22-第22章 抗中性拉细胞胞浆抗体及其靶抗原

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目录:

第一节 概 述

第二节 抗中性粒细胞胞浆抗体及其靶杭原
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& O" M5 E, I; L9 s- R第三节 ANCA相关疾病及ANCA的临床意义

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抗中性粒细胞胞浆抗体(anti-neutrophil cytoplasmic antibodies, ANCA)是一种以中性粒细胞和单核细胞胞浆成分为靶抗原的自身抗体，可在原发性小血管炎患者的血清中检测到，目前已经成为部分原发性小血管炎的特异性血清学诊断工具。ANCA由Davies等人于1982年首先提出，在以正常人中性粒细胞为细胞基质检测抗核抗体时，在6例患有节段坏死性肾小球肾炎患者的血清中，发现了抗细胞浆成分的自身抗体，但由于当地正流行虫媒病毒的感染，因此，认为ANCA的发生有可能与虫媒病毒感染有关，故ANCA对血管炎的诊断价值并没有引起重视。直到1985年，ANCA的确切临床诊断意义才得以明确，van der Woude等发现在重症韦格纳肉芽肿(Wegener's granulomatosis, WG)病人血清中存在着ANCA，而且ANCA的滴度与WG的病情活动密切相关，临床病情减轻或缓解时则该抗体的滴度下降或消失。因此，认为ANCA是诊断WG的特异性血清学诊断工具。两年后，Savage等发现另一种原发性小血管炎——显微镜下多血管炎(microscopic polyangiitis, MPA)亦和ANCA相关，且亦能反映病情活动。除上述系统性小血管炎外，1988年Falk和Jennette又发现在部分少免疫沉积型(pauci-immune)节段坏死性肾小球肾炎和新月体性肾炎(necrotizing crescentic glomerulonephritis, NCGN)病人血清中也检测到ANCA。一般认为少免疫沉积型NCGN就是MPA的一种亚型，病变仅局限于肾脏，其中多数病人在疾病的后期可发展为全身的病变，临床上可以表现为典型的MPA或WG。随后，在变应性肉芽肿性血管炎(Churg-Strauss syndrome, CSS)中也发现约半数患者血清中存在ANCA。目前人们将 WG, MPA和 CSS称为ANCA相关小血管炎。  

: @' h8 N+ A) W2 Y( w& Q      ANCA相关小血管炎是西方国家最为常见的自身免疫病之一，WG和CSS的总发病率约为19.8/百万人口，MPA为5～7/百万人口。由于ANCA的应用和人们对ANCA相关小血管炎认识的提高，其发病率在90年代后期较80年代有明显提高，因此其确切发病率还有可能进一步提高。我国尚无确切调查资料，其发病率尚不清楚。20世纪80年代我国对此类疾病认识不足，自ANCA在我国推广应用以来，我国对该类疾病的认识也得到不断提高，近5年北京大学第一医院新诊断了298例ANCA阳性小血管炎患者，提示我国原发性小血管炎并不少见。

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一、ANCA的检测技术   
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, H$ D: }) Z, c6 \; u7 w8 o6 A       1.间接免疫荧光法   
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  p' J, y1 K  A: S      (1)间接免疫荧光(indirect immunofluorescence, IIF)法:IIF法是最先应用，目前仍最常用、经典的ANCA检测方法。应用酒精固定的正常人中性粒细胞可产生两种荧光形态:在胞浆内呈粗大颗粒状、不均匀分布者称为胞浆型ANCA(cANCA)(彩图22一1),荧光沿细胞核周围呈线条状分布者称为环核型ANCA(pANCA)（彩图22一2)，而在胞浆分布，但呈均匀细颗粒状，有时核周重染则称为非典型性ANCA(aANCA)(彩图22一3)。进行 IIF法检查时应注意如下几个问题:① 根据1988年哥本哈根第一届 ANCA国际研讨会所制定的方法，应选用正常健康人肝素抗凝血分离全体白细胞。其中除ANCA的靶细胞中性粒细胞和单核细胞外，还应包括淋巴细胞和嗜酸性粒细胞，后两者是非常重要的内参照物。淋巴细胞可用来判断自身抗体是否为中性粒细胞和单核细胞所特异的，从而帮助鉴别pANCA和抗核抗体。pANCA仅识别中性粒细胞和单核细胞，而ANA则同时还识别淋巴细胞的细胞核。嗜酸性粒细胞有两种用途:其一，帮助判断ANCA的荧光强度，以嗜酸性粒细胞的天然荧光为基础并与其相比较，可确定ANCA荧光亮度的分级。其二，嗜酸性粒细胞天然荧光还可以帮助判断制片是否成功，细胞形态是否满意。嗜酸性粒细胞胞浆内有粗大均匀一致的颗粒，在紫外光激发下可产生暗黄绿色的均匀一致自然荧光。典型的cANCA为胞浆不均匀着色，在细胞核核叶之间有重染，有时形成小团块或粗大颗粒状(彩图22一1)。故应注意区分，切忌将二者棍淆。② 分离的白细胞应均匀一致呈单层涂布于玻片上，不可有成堆或重叠的白细胞。标准的方法是选用细胞离心机(cytospin)将白细胞甩在玻片上呈单层均匀分布，并可使细胞浆及细胞核平展充分。③目前最为常用的固定剂是预冷的纯酒精，纯酒精和丙酮一样，属于非交联性固定剂，可增加细胞膜结构的通透性，ANCA特异性靶抗原物质可从中性粒细胞胞浆的嗜天青颗粒中释放出来。这样，带正电荷的蛋白质如髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)则可穿透膜结构游离出来而吸附在带负电荷的细胞核周围，致使抗MPO自身抗体形成环核型的pANCA;而cANCA的靶抗原蛋白酶3 (proteinase 3 , PR3)属弱阳性离子或中性蛋白，不会吸附于细胞核周围，因此就形成胞浆型的cANCA。如应用交联性固定剂如福尔马林或多聚甲醛，则ANCA均表现为cANCA，而无pANCA。这是由于细胞胞浆内许多ANCA特异性靶抗原不能从嗜天青颗粒中释放出来，带正电荷的MPO等蛋白质也被固定在嗜天青颗粒内而不能穿透膜结构，因此不能区别不同的ANCA类型。此外，交联性固定剂可使部分ANCA的特异性抗原失去与自身抗体相结合的能力，即丧失了抗原决定簇。基于上述两种原因，目前国际上并不主张应用交联性固定剂。但应注意的是，甲醛固定能破坏核抗原，可阻止与ANA的结合，因此在鉴别ANCA和ANA时有一定应用价值。④ 每次检测均应有阴性对照、cANCA和pANCA的阳性对照。有条件者应在每张玻片上加一阴性对照(每张玻片上至少有两孔白细胞膜方可)。⑤ 判断 IIF结果时，应由两位受过培训的医师或技师在双盲条件下读片以除外主观因素。读片时应在低倍镜下判断是否阳性，在高倍镜下观察形态并判断cANCA或pANCA.  

      (2)ANCA和ANA的鉴别:由于许多自身免疫病患者血清中存在ANA，应用IIF法检测ANCA时，pANCA和ANA很难区分，应引起特别注意。现ANA检测多采用人喉癌上皮细胞(HEp-2细胞)作为抗原基质细胞。早在50年代末ANA检测初期，曾采用人白细胞涂片作为抗原基质细胞的IIF法检测ANA。应用酒精固定中性粒细胞抗原片检测ANCA时，如被检血清中存在ANA，特别是荧光染色表现为均质型(homogeneous pattern)的ANA，易在中性粒细胞核上表现为核周型或核周型/均质型荧光染色，很难同pANCA鉴别。如同一份血清pANCA阳性同时伴有均质型ANA阳性，则鉴别更为困难。有学者提出可利用基质细胞片中存在的少量的淋巴细胞来除外ANA，但如ANA和ANCA同时存在则无能为力。因此，ANA阳性，特别是强阳性者，单独应用IIF法检测ANCA是不可取的，其结果也是不可靠的。   
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/ c0 @8 Z; o8 o4 S0 c      为避免ANA的干扰及提高区分不同ANCA荧光类型的能力，目前许多实验室采用多种抗原基质细胞(如乙醇固定抗原片/甲醛固定抗原片/IEp-2细胞抗原片)联合检测，通过被检血清在不同基质细胞上的反应，综合判断检测结果。如乙醇固定抗原片检测表现为pANCA，再用甲醛固定片检测，真正的pANCA则转换为cANCA, ANA假阳性则表现为阴性。这种荧光染色类型的转变现象有助于pANCA或aANCA与ANA的鉴别。   

* R6 A4 d' ?0 U' P      2.固相放免和酶联免疫吸附法   

      1987年Savage等首先推出了应用放免分析(radioimmunoassay, RIA)的方法检测ANCA，其抗原是应用超声粉碎方法获得的中性粒细胞的酸性浸出物，理论上它应包含所有中性粒细胞的胞浆成分，故又称之为总抗原。由于长期应用放射性同位素对操作人员身体有害，且放射性同位素存在着半衰期的间题，故现在一般采用酶联免疫吸附法(ELISA)。应用总抗原的ELISA方法，理论上应该能检测到任何一种ANCA抗原，但实际上并不然，原因如下:①中性粒细胞胞浆内成分很多，每种蛋白质的含量不一，含量多者相对易于检测到。如MPO是胞浆内的主要蛋白成分，所以易于包被到酶联板上。②不同的蛋白质在同一种包被液的条件下(如常用的0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)，结合到ELISA板上的能力也不同，有的蛋白甚至不能结合。不同厂家的酶标板其结合能力有时也有一定差别。③蛋白质被消化或降解，由于中性粒细胞胞浆内富含各种蛋白水解酶，可能相互作用。例如，在中性pH值的条件下，PR3和人白细胞弹力蛋白酶(human leukocyte elastase, HLE)可以迅速降解杀菌/通透性增高蛋白(bacteriocidal/permeability-increasing protein, BPI)。与肾脏小血管炎关系密切的二种主要抗原MPO和PR3在适宜的抗原浓度下均可以包被到ELISA板上，故总抗原ELISA法仍有一定应用价值，但这种方法无法得知抗原的特异性，临床应用已经日益减少。   

" W+ P: n; x  F# ]" `4 r! B      随着ANCA特异性靶抗原逐一被发现并得以纯化，抗原特异性ELISA检测方法近年来得以迅速推广，由于不同的ANCA及其不同的抗原系统往往和临床上不同的疾病或临床综合征相关，故抗原特异性ELISA显示出了它们独特的优点。它们更敏感、更特异，可以直接用于协助临床相关疾病的诊断和分类，在指导治疗、判断病情复发上意义重大。一些重要的抗原特异性ELISA已经商品化，在发达国家已列为常规检查项目。抗原特异性ELISA多用高纯度的抗原直接包被ELISA板。但检测PR3抗体也可以应用夹心法ELISA，该方法以抗PR3单克隆抗体包被到ELISA板上并用其捕捉PR3分子作为抗原，目前认为夹心法ELISA较直接包被的抗原特异性 ELISA更敏感，因为 PR3的抗原决定簇是立体构型，PR3直接结合到ELISA板上会丧失部分抗原决定簇。因此目前国际上更提倡使用夹心法ELISA检测抗PR3抗体。   
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+ c% N# f3 b1 {+ o$ a# q. u' P      3.其他检测技术   

      临床常规检测ANCA一般选用IIF法作为筛选试验(screening test)，抗原特异性ELISA作为确证试验(confirmation test)，其他还有免疫印迹法(immunoblot analysis, IB)、免疫沉淀法(radioimmuno-precipitation assay,RIP)、斑点杂交(印迹)法(dot blotting)、流式细胞术(flow cytometery, FCM)等均可以被用于检测ANCA。但临床应用并不广泛，其中部分项目主要用于科研。

5 a  m* u. V: P' _" a   二、ANCA的抗体类型和亚型   

       I . ANCA的抗体类型   

9 Q; e  v0 k3 j" u2 t5 l      目前临床检测的ANCA主要为IgG型自身抗体，但其他类型的ANCA也有报道。如应用IIF法可以在MPA患者的血清中检测到IgM-ANCA，而且它主要见于合并肺部出血的小血管炎。同样应用IIF法，在20世纪90年代初，有个别报道在过敏性紫癜病人的血清中检测到IgA型ANCA，但未能得到他人的证实。1995年，Zhao等在囊性纤维化病人血清中则应用 IIF法和抗原特异性ELISA法明确检测到IgA型ANCA。
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      由于临床上常规并不检测IgM型和IgA型ANCA，这些类型的ANCA的发生率有可能被低估。   

      2. IgG-ANCA的亚型   

  t/ y! ]2 \8 F6 D. `. P      正常人IgG可以分为4种亚型，即IgGl,IgG2, IgG3和IgG4。不同亚型的理化性质和生物学功能并不完全一致。如IgG3的半衰期只有7天，而其他亚型为20～21天;IgGI和IgG3具有较强的固定补体和结合吞噬细胞的能力。IgG型ANCA也可以分为4种不同的亚型，在疾病的活动期4种亚型的阳性率均较高，但在缓解期IgG3阴转的百分率最大，因此，目前人们认为ANCA的IgG3亚型与小血管炎的临床活动性关系最为密切，而IgG4则主要与长期抗原刺激有关，可以维持长期阳性。因此，临床上可以见到部分ANCA相关小血管炎患者经过免疫抑制治疗后临床完全缓解，但血清中ANCA虽然滴度下降但并未转为阴性。
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! j0 s  S5 ?. N5 {1 F   三、ANCA的特异性靶抗原   
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& Z% `. q5 y- n, E3 x      自ANCA被发现可作为诊断部分原发性小血管炎特异性的血清学诊断工具以后，80年代末以来ANCA特异性靶抗原就逐渐被一一发现。到目前为止，已有多种中性粒细胞胞浆成分被证实为ANCA的抗原，如表22一1所示，这里着重介绍几种较重要的ANCA抗原。
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      1.蛋白酶3   
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, ^( k0 A. B' J7 U- s$ L5 z5 A- w) Y# }      蛋白酶3 ( proteinase 3, PR3)于1989年被证实为cANCA的靶抗原。PR3是中性粒细胞嗜天青颗粒中被发现的第三个中性丝氨酸蛋白酶，并因此得名。前二个分别为人白细胞弹力蛋白酶(human leukocyte elastase, HLE)和组织蛋白酶 G ( cathepsin G)。PR3是 1978年由Baggiolini等人首先报道的26 . 8kD的糖蛋白，由228个氨基酸组成，其氨基酸序列和1989年由Bories等报道的促髓素(myeloblastin) , 1980年Campanelli等报道的中性粒细胞抗生素-p26b蛋白是完全一致的。故目前认为这三种蛋白描述的是同一成分。PR3是一个等电点在8.0左右的蛋白酶，其蛋白酶的活性可以由数个不同的底物来检测。αl-抗胰蛋白酶(α-AT) , α2-巨球蛋白和elafin是PR3生理条件下的酶抑制剂。在聚丙酰胺电泳上，PR3表现为29kD左右的三条条带。PR3存在于中性粒细胞和单核细胞的嗜天青颗粒(初级颗粒, α颗粒)。炎症反应或中性粒细胞受到炎性因子刺激时，颗粒的膜结构就会和细胞膜相融合并导致脱颗粒反应。PR3像弹力蛋白酶一样可以消化、降解不溶于水的弹力蛋白。在轻度偏酸的条件下，PR3比弹力蛋白的蛋白水解酶活性更强。PR3还可以消化降解许多不同的细胞外基质，如纤粘连蛋白(fibronectin)、胶原Ⅳ (collagen Ⅳ) ,层粘连蛋白(laminin )，但它不能降解间质的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原。1988年Kao等在动物试验中证实吸入 PR3可以导致仓鼠出现严重的肺气肿，提示其具有重要的病理生理功能。此外，PR3可以促进中性粒细胞迁移通过基底膜，PR3还可以消化、降解某些吞噬到中性粒细胞内的微生物。PR3广泛的生理功能显示它具有重要的防御功能和潜在的病理生理作用。   

      抗PR3抗体相对特异性较高，主要用于诊断WG，患者血清中的抗 PR3抗体可以识别PR3分子上不止一个抗原决定簇。免疫印迹方法证实，其抗原决定簇具有三维立体构象，应用还原剂打开二硫键以后则可以使其丧失抗原决定簇而不能与抗PR3抗体结合。  
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      2.髓过氧化物酶   
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      Falk和Jennette在1988年发现髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)为pANCA的主要靶抗原，但并非所有pANCA阳性的血清都识别MPO。同样，有一少部分抗MPO抗体阳性的血清也可以产生cANCA。MPO在中性粒细胞嗜天青颗粒中含量最为丰富，可以占到中性粒细胞干重的5%。MPO含有亚铁血红素，呈绿色。MPO在酸性条件下不稳定，可以丧失其酶活性和MPO-ANCA的抗原决定簇。MPO是带正电荷的糖蛋白，等电点≥11，其分子量在133～155kD。MPO分子结构中包含二条重链和二条轻链，重链约为57kD，而轻链约为16～18kD。MPO可以催化过氧化氢(H2O2)和卤素(Cl-)反应产生次氯酸，在中性粒细胞的氧爆炸或产生超氧阴离子的过程中具有重要作用，并因此可作为抗生素杀死吞噬的微生物。MPO是骨髓造血过程中髓系分化的一个极为有价值的标记物，而且在诊断髓系细胞(如粒细胞、单核细胞)白血病中具有重要意义。   
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$ y7 |& n7 `2 B' q- M  `) l* O+ o$ q; r      抗MPO抗体可见于MPA, CSS和少免疫沉积型NCGN。同抗PR3抗体一样，患者的抗MPO抗体也可以识别 MPO分子上不同的抗原决定簇，在高温、酸性以及应用还原剂等条件下可丧失抗原决定簇。   

       3.杀菌/通透性增高蛋白   

  e" K+ D! }! J' Q1 Y2 }3 l       杀菌/通透性增高蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein, BPI)是 1995年由Zha。等人发现的另一重要ANCA抗原。BPI是中性粒细胞嗜天青颗粒内的55kD的具有杀菌活性的蛋白质，是中性粒细胞内最为重要的抗革兰阴性菌的内源性抗生素。它可以杀灭多种革兰阴性细菌，如绿脓杆菌。除此之外，BPI还可 以 中和 血 清 中游 离 的 脂 多 糖(lipopolysaccharide, LPS )，具有明确的抗感染、纠正内毒素血症的作用。BPI由两部分组成，其氨基端具有全部杀菌功能，是很强的带正电荷的碱性蛋白，而羧基端则镶嵌在嗜天青颗粒的膜上，具有免疫调理功能。BPI分子由487个氨基酸构成，从第240～245个氨基酸是潜在的弹力蛋白酶的消化位点。最近的研究已经证实，在中性pH值的条件下，BPI可以迅速被PR3和人白细胞弹力蛋白酶(HLE)降解，这可能是BPI不易被常规的IIF法和总抗原ELISA法检测到的原因。   

3 U, v( U3 d: O, @- l9 A      BPI是IIF法中不典型ANCA的靶抗原之一。抗BPI抗体的特异性不高，可以见于原发性小血管炎、炎性肠病、慢性炎症性肺部疾病(特别是长期痰中绿脓杆菌阳性的患者)如囊性纤维化(cystic fibrosis)和弥漫性全小支气管炎(diffuse panbronchiolitis,DPB)等。抗BPI抗体既可以为IgG型，也可以为IgA型，提示其可能与粘膜免疫相关。   

      BPI的杀菌和中和内毒素功能可以被多克隆兔抗人BPI的IgG阻断，提示该多克隆抗体封闭了BPI的氨基端，但近年的研究发现患者的抗BPI抗体并不能抑制 BPI的杀菌和中和内毒素的功能。通过重组的嵌合蛋白(chimeric protein)的研究发现，人抗BPI抗体所识别的抗原决定簇主要位于BPI分子的羧基端，进一步的研究证实患者的抗BPI抗体可以影响BPI分子的免疫调理功能。   
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      4.中性丝氨酸蛋白酶家族的其他成员   

" X+ A; O$ [. Y: b, |      中性丝氨酸蛋白酶家族，共有四个成员，即人白细胞弹力蛋白酶(FILE)、组织蛋白酶 G(cathepsin G), PR3和天青杀素(azurocidin)。这四个成员先后均被证明系 ANCA靶抗原。除PR3外，其余三个成员均非ANCA的主要抗原。由于这四个成员的氨基酸序列同源性很高，故被归为同一家族。除天青杀素外，其余三者均具有蛋白水解酶的活性，它们既具有相同的、也有各自特异的底物。三者均可消化、降解许多细胞外基质，在炎症的病理生理过程中很可能有重要意义。四个成员均具有杀菌、抑菌的能力，特别是天青杀素，在中性粒细胞内是仅次于BPI的抗革兰阴性细菌的内源性抗生素。四个成员的分子大小基本相同，在聚丙酰胺电泳上均表现为29kD左右的条带。   
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4 r: n' d. K/ k, R: Z/ ^0 Z      除抗PR3抗体以外，以另外三种蛋白为抗原的ANCA在 IIF法均表现为 pANCA或aANCA，其临床意义尚不明确，但近期在北京大学第一医院的研究发现，甲状腺功能亢进患者应用丙基硫氧嘧啶(propylthiourcil, PTU)诱发的ANCA可以识别上述抗原。   

5 U* x1 p) L! C- i% v4 W% g" d      5.其他少见ANCA抗原   

# B) J% N6 q- z      在中性粒细胞嗜天青颗粒中，防御素(defensins)和R-葡萄糖醛酸酶(β-glucoronidase)亦是ANCA特异性抗原。防御素是29～43个氨基酸组成的碱性多肽(带正电荷)，人中性粒细胞的防御素共有四种，其中前三种之间只有一个氨基酸的区别，防御素亦为中性粒细胞嗜天青颗粒中的主要蛋白成分(占总细胞重的5%～18%)。防御素也具有抗菌素的活性，可以杀灭细菌、真菌甚至病毒。在体外，防御素还具有其他生物特性，如细胞毒性(诱导DNA崩解)、化学趋化等。β-葡萄糖醛酸酶则是75kD的酸性水解酶。抗防御素抗体主要见于慢性高反应性盘尾丝虫病(chronic hyperreactive onchocerciasis，一种热带的寄生虫感染性疾病)。   

+ ^9 _+ n' E8 e+ r4 l# z! Y- S      在特异性颗粒中，乳铁蛋白(lactoferrin )为ANCA的一个特异性抗原。乳铁蛋白是由692个氨基酸组成的单链铁结合蛋白，约78kD。人类的乳铁蛋白除存在于中性粒细胞外，还可以在乳汁、眼泪和唾液中发现。抗乳铁蛋白抗体可见于系统性红斑狼疮、药物诱发的ANCA阳性小血管炎等。而溶菌酶(lysozyme)在嗜天青颗粒和特异性颗粒中均存在，并由Schmitt于1993年首先报告为ANCA靶抗原，但其临床意义至今还不清楚。乳铁蛋白和溶菌酶均具有抑菌功能。   

* b6 e0 i) j+ m0 V7 H" W       除颗粒成分外，中性粒细胞胞浆成分也可作为 ANCA抗原，如α-烯醇酶(α-enolase )是48kD的胞浆抗原，催化酶(catalase)为57kD的胞浆抗原，两种胞浆抗原均可以被部分炎症性肠病患者血清中的ANCA所识别，但其临床意义尚不清楚。

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一、ANCA的临床意义
( s, j1 W3 T: ]3 d. }       除原发性小血管炎和部分肾小球肾炎外部分炎症性疾病及结缔组织病等亦和ANCA相关，ANCA相关疾病与ANCA的关系详见（表22-2）。关于ANCA的临床应用价值，目前国际上得到广泛认同的是用于诊断ANCA相关小血管炎。近年欧洲14个小血管炎研究中心联合开展了对ANCA检测方法的评估，分别检测了cANCA, pANCA, PR3-ANCA和 MPO-ANCA用于诊断各种主要原发性小血管炎的敏感性和特异性(表22一3)，但进一步分析发现IIF法联合抗原特异性 ELISA是值得推荐的，如cANCA合并抗PR3抗体阳性或pANCA合并抗MPO抗体阳性，则用于诊断原发性小血管炎的特异性可以达到99% ，对WG, MPA和NCGN的敏感性分别可以达到 73%,67%和82%。  
      本节主要介绍各种常见的ANCA阳性疾病，以及ANCA的意义。
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   二、ANCA相关小血管炎   
( ~2 g4 n. ^2 X" d0 G7 G      1.韦格纳肉芽肿（WG）   
, p8 Z! ^9 q( _2 a- \      WG病因尚不清楚，主要特点为上、下呼吸道的坏死性肉芽肿性小血管炎、肾小球肾炎及其他系统性小血管炎性损害。而局限型WG指无肾小球肾炎，仅表现为上、下呼吸道病变。WG是一种经常复发的自身免疫病。自1985年van der Woude把WG和ANCA联系在一起以后，美国和欧洲的许多研究机构均证实ANCA的滴度和WG的临床病情密切相关。应用IIF法检测ANCA时，无论用酒精或甲醛固定中性粒细胞，均只产生一个典型的c-ANCA荧光形态。c-ANCA对WG的诊断、指导治疗和判断病情复发都具有重要意义。少数病人也可以表现为p-ANCA。
9 o/ h+ V  w) B       c-ANCA在诊断活动性WG时，其敏感性可以达到 60%～90%，而其特异性可高达95%，而对于非活动期或缓解期，则敏感性较低或为阴性。如果病变仅局限于上、下呼吸道(局限型WG)时，有人报道认为只有50%的病人c-ANCA阳性，且IIF的荧光形态并无不同。大多数WG病人的ANCA特异性靶抗原已被证实为PR3，但确有少数(10%～30 %) WG病人的ANCA针对其他靶抗原，如MPO和HLE。   
      一般说来，应用IIF法的c-ANCA滴度和应用PR3-ELISA所得的滴度是成正比的。但后者更敏感、更特异，且可以定量测定。由于抗PR3自身抗体和WG的临床病变活动基本一致，故定期检测抗PR3自身抗体可用于指导临床治疗。病人进入缓解期后，如果持续或间断c-ANCA或抗PR3抗体阳性，则提示该病人复发的危险性极大。但有一小部分WG病人的ANCA或抗PR3抗体滴度并不与临床病情平行，所以不应该单纯应用c-ANCA或抗 PR3抗体作为指导治疗的惟一标准。   
      2.显微镜下多血管炎(MPA )   
' y5 D7 |# n; V7 y. y. i1 [      MPA的特点是累及小血管的非免疫复合物性坏死性血管炎，常可累及肾脏引起坏死性新月体性肾小球肾炎，大多数病人伴有非肉芽肿性的系统性小血管炎，常可侵犯全身多数器官，在全身症状出现之前可首先表现为个别器官的受累。大多数MPA病人是p-ANCA阳性，而绝大多数MPA病人具有抗MPO抗体，也有一小部分病人具有抗PR3抗体。   
6 t) s# f" C0 p# f/ u! i' V9 u      由于p-ANCA并非对某一种疾病具有特异性，应用抗MPO抗体诊断MPA比pANCA要特异得多。虽然抗MPO抗体主要和MPA相关，但也可以见于其他炎症性疾病。多数抗MPO抗体阳性的MPA病人中，抗体和临床病情密切相关，可以用于协助诊断、指导治疗和判断复发。  
/ P' q2 J* t# }- d: x' l; m; p: l      MPA较特殊的一个临床综合征是肺-肾综合征，可以是肾脏病较重，也可以是肺部症状较重，甚至大量肺出血而威胁病人的生命。肺-肾综合征易与Goodpasture综合征相混淆。抗肾小球基底膜(GBM)抗体和ANCA的检测可协助鉴别。因为两者的治疗方案、预后有很大不同，因此鉴别十分重要。值得注意的是，ANCA阳性的肺-肾综合征往往有IgM型ANCA，而且IgM型ANCA和肺出血密切相关。   
      3.节段坏死性肾炎和新月体性肾炎(NCGN)   
% K0 w  X) T2 L9 l4 G      这组病人临床多表现为急进性肾炎综合征，即在血尿、蛋白尿、水肿和高血压基础上，短期内出现少尿，肾功能迅速衰退。肾脏病理上，光学纤维镜检查可为节段性毛细血管绊纤维素样坏死和/或肾小球内新月体形成。免疫病理则显示为少量或无免疫复合物沉积，也就是相当于原发性RPGN Ⅲ型。这组病人有 50%～70% ANCA阳性，其特异性靶抗原主要为MPO，少数为PR3。抗体滴度和临床病情密切相关。如前所述，目前认为该组疾病为MPA的肾脏局限型，也就是以肾脏为首先受累器官的MPA。但部分病人在病情发展过程中，也可以出现其他脏器受累甚至可发展为多器官受累的典型MPA。ANCA阳性的RPGN病人对强化免疫抑制治疗效果肯定。早期诊断，及时应用强化免疫抑制治疗，多数患者可以脱离透析。北京大学第一医院肾内科在20世纪90年代10年中收治的经肾活检证实的100例新月体性肾炎中，32例ANCA阳性。ANCA阳性者对强化免疫抑制治疗的反应明显较抗GBM抗体阳性者为好。对于肾活检病理未达到新月体性肾炎诊断标准(50%的肾小球有大新月体形成)者，特别是主要以局灶、节段肾小球毛细血管绊纤维素样坏死为主的患者则治疗效果更为肯定。多数患者肾功能可完全恢复正常。   
      4.变应性肉芽肿性血管炎(CSS)   
6 Z! n* m4 s! z      CSS病人一般有过敏的表现，如哮喘、嗜酸性粒细胞增多和系统性血管炎。CSS亦为ANCA相关疾病，其主要靶抗原为MPO。然而，Guillevin等报道了12例CSS患者，8例为ANCA阳性，IIF法检查为pANCA和cANCA各4例，4例pANCA均识别MPO，而只有1例cANCA阳性血清识别PR3，所以作者认为CSS的ANCA靶抗原并非仅限于 MPO，还有尚未发现的抗原。由于 CSS是一个较为少见的疾病，还有待大宗报道揭示ANCA与该病的关系。
5 a6 @' R0 X  D8 c4 e2 C   三、其他原发性小血管炎   
      主要指过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura, HSP)和皮肤白细胞破碎性血管炎(cutaneous leukocytoclastic angiitis)。   
      HSP是一典型的小血管炎，可侵犯皮肤、关节、消化道和肾脏，免疫病理为在肾小球或血管壁以IgA为主的免疫成分沉积。1994年Ronda等报道了14例HSP病人中有11例病人存在IgA 型ANCA，其IIF法和应用中性粒细胞酸性粗提物的总ANCA-ELISA均为阳性，其中4例高滴度IgA-ANCA血清在免疫印迹法中可以检测到51kD的蛋白条带并认为该条带为靶抗原，但这一研究结果一直未能得到其他研究的证实，因此HSP与IgA-ANCA的关系也待深人阐明。   
' @" e% G- r9 R* {- A1 n      皮肤白细胞破碎性血管炎虽仅局限在皮肤，但各种ANCA阳性的小血管炎如 WG,MPA和CSS的皮肤病变均可以在病理上表现为典型的皮肤白细胞破碎性血管炎，部分患者随着病变的进展也可以出现典型的系统性小血管炎表现。国内罗婷等在1997年对11例皮肤白细胞破碎性血管炎患者进行了ANCA检测，发现3例患者为pANCA/抗MPO抗体阳性，随访数月内均发展为系统性小血管炎。因此，对皮肤白细胞破碎性血管炎进行ANCA检测是必要的。   
0 T! n: E% Q. S' ?  r9 v   四、药物引起的ANCA相关小血管炎   
      几乎每类药物均有引起药物性血管炎的报道。Holder等人总结了 1965年至 1999年 12月MEDLINE上报道的药物及其相关的血管炎反应，10种报道最多的导致血管炎的药物为丙基硫氧嘧啶(PTU), 肼苯哒嗪、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、头孢克洛、美满霉素(米诺环素)、青霉胺D、苯妥英、异维A酸和甲氨蝶呤。因存在未报道、未发表和/或未诊断的病例，所以以上10种药物可能未必是临床实践中引起血管炎发生率最高的药物。   
$ X1 G# {2 \3 |# e. F% Z4 `      很多药物可以引起ANCA阳性小血管炎。其中研究较充分的是治疗甲状腺功能亢进的药物丙基裗氧嘧啶(PTU)。1953年Morrow等第一次报道PTU可引起药物性狼疮。1993年Dolman等首次提出PTU可引起 ANCA相关小血管炎的概念，他们检测了6例PTU引起的ANCA相关血管炎的靶抗原:6/6例HLE阳性，3/6例MPO阳性，5/6例 PR3阳性。此后国外陆续出现类似报道。国内徐旭东等首次总结了4例应用PTU治疗甲亢后引起ANCA阳性小血管炎的病例，均有典型的多系统受累表现。应用 IIF和抗原特异性ELISA检测ANCA及其靶抗原，结果均为P-ANCA阳性;所有患者血清均识别MPO,HLE、乳铁蛋白和组织蛋白酶 G, 3/4例识别天青杀素，2/4例识别PR3，所有血清均不识别BPI，说明PTU诱发的ANCA是多克隆自身免疫反应，停药后临床症状缓解，ANCA滴度下降，但可以保持长期阳性。近年来日本和欧洲均进行了大规模的抗甲状腺药物与ANCA相关血管炎的前瞻性研究。Sera等人检测了56例服用PTU的甲亢患者血清，MPO-ANCA阳性为21例(37.5%),42例初发未治疗患者和21例服用他巴唑(MMI)的患者 MPO-ANCA检测均为阴性，所有患者PR3-ANCA检测均为阴性。Noh等人则随访观察了102例初发Graves病患者，所有患者未治疗前MPO-ANCA检测均为阴性，在追踪的73例服用PTU治疗的患者中3例分别在第13,16,17个月出现ANCA阳性。   
       Graves病和慢性淋巴细胞性甲状腺炎均属于自身免疫性甲状腺疾病，已有文献报道Graves病患者的血清中可检测到多种自身抗体，如ANA等。为探讨ANCA是否为甲亢患者自身免疫紊乱的表现之一，了解甲亢患者服用PTU,MMI后ANCA及血管炎的发生率，明确其特异性靶抗原，北京大学第一医院对216例原发甲亢患者进行了ANCA的检测，发现未治疗者和服用MMI者ANCA的发生率分别为5.9%和6.5%，而服用PTU者其ANCA的发生率为22.6%(p<0.05)。ANCA的发生与病程、年龄和PTU累积剂量无关，6/31(19.4%)例ANCA阳性的患者出现小血管炎的临床表现。对所有ANCA阳性者而言，其主要靶抗原为乳铁蛋白(52%)和HLE(27%)，而所有4例MPO阳性和2/3的PR3阳性患者都有小血管炎的临床表现。以上资料说明PTU可以诱发ANCA的产生，部分患者可以在临床上发生小血管炎，抗MPO抗体和抗PR3抗体可能提示临床小血管炎的发生。   
       药物引起的ANCA阳性小血管炎的临床表现与ANCA阳性的原发性小血管炎并无明显区别，既可以表现为单个脏器受累，也可以表现为多脏器受累。肺、肾受累多进展迅速，严重者可危及患者生命。   
# r) V0 g; X. S0 r$ v. U   五、系统性红斑狼疮和其他自身免疫性疾病   
      小血管炎是系统性红斑狼疮(SLE)最为重要的病理基础之一。近年来国外报道，应用IIF方法在 SLE病人中ANCA的发生率从25%～60%不等，但和临床病变活动似乎关系不大。由于大部分 SLE病人血清中存在着ANA，很难和真正的pANCA相区分，故应注意ANCA检测的方法学，区别方法如前所述。单纯应用IIF法检测ANCA是不可靠的。因此，国内外多数研究采用抗原特异性ELISA方法，但国内外报道的SLE-ANCA靶抗原也不尽一致，其抗原可以是MPO,HLE、乳铁蛋白和组织蛋白酶G。Spronk等最近对84例缓解期SLE病人和25例复发者的血浆研究发现:SLE病人中抗组织蛋白酶G、抗乳铁蛋白抗体和抗 MPO抗体均有一定阳性率。然而，这些抗体的发生率在复发的病人中显著地高于缓解期的病人，故作者认为ANCA可能与SLE的疾病活动有关。北京大学第一医院对95例经肾活检证实的狼疮肾炎患者血清进行了ANCA检测，发现62.1%的血清识别组织蛋白酶G,8.4%的血清识别乳铁蛋白，无1例血清识别MPO和PR3,仅 1例识别BPI。进一步的研究还发现，抗组织蛋白酶G抗体与狼疮肾炎患者的肾脏病理活动指标密切相关。   
$ K/ m- a+ y; m1 H1 y      在1967年，Faber和Elling报道了在类风湿关节炎出现的一种称之为粒细胞特异性抗核抗体(GS-ANA)的自身抗体。近年来，人们认为GS-ANA和pANCA有一定的交叉，甚至有人认为GS-ANA就是 pANCA。文献中显示30%～50%左右的 RA病人是 ANCA阳性。IIF方法上的荧光形态是非典型的 ANCA(aANCA)，其特征是细小颗粒样荧光伴有核周边的重染。有的作者认为pANCA阳性的RA病人多有关节外病变和血管炎，特别是当抗乳铁蛋白和抗弹力蛋白抗体阳性时，这一趋势更为显著，但尚未被更多的研究所证实。   
       其他ANCA阳性的自身免疫病还包括皮肌炎、系统性硬化等，其临床意义和靶抗原还有待进一步研究。
9 K- F6 G. {, t6 ^  O! o0 C1 O   六、炎性肠病和自身免疫性肝病   
      炎性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)主要指溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn' s disease, CD)，应用IIF法可以在血清中发现ANCA。最近几年来的研究证实，UC病人中49%～83%的病人ANCA为阳性，而CD病人为19%～40% 。在UC病人中，临床进展快、症状重者血清ANCA的检出率高。UC和CD病人的ANCA均为pANCA，有人发现应用多聚甲醛取代乙醇固定中性粒细胞时，UC病人中76%的pANCA和CD病人中50%的pANCA阳性血清可以转变为cANCA阳性。这个结果说明大部分IBD-ANCA的靶抗原位于细胞浆内，且很可能是碱性蛋白质(等电点大于7.0);也提示IBD-AN-CA的靶抗原很可能由不止一种蛋白质构成。为研究IBD ANCA靶抗原，免疫印迹法被广泛应用，用中性粒细胞的盐浸出物作为抗原，多种不同大小的蛋白条带可以被炎性肠病患者的血清所识别。目前公认的主要ANCA靶抗原包括:BPI、乳铁蛋白、组织蛋白酶G，近年又发现α-烯醇酶和催化酶也是该类疾病的靶抗原。国内刘新光等通过肠粘膜活检证实:ANCA阳性者肠粘膜小血管炎的发生率显著高于ANCA阴性者。以上结果说明ANCA可以作为炎性肠病，特别是溃疡性结肠炎的辅助性诊断手段，其靶抗原具有异质性，提示ANCA可能参与了该类疾病的发病。   
      自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis, PSC)和原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)也和 ANCA相关。22%～75%的慢性活动性肝炎为pANCA阳性，多数病人还合并PSC。如PSC同时合并UC，则ANCA检出率往往会升高。肝胆疾病的pANCA靶抗原和IBD很类似。
   七、感染性疾病   
8 E" e1 h3 m5 L( ?7 U" S8 _, {       感染可以引起血管炎，在感染性疾病中也可以发现ANCA。抗BPI抗体与囊性纤维化(cystic fibrosis, CF)密切相关是一个重要的例证。CF是西方白种久中居第一位的遗传病，主要遗传缺陷是粘膜Cl-通道功能障碍。儿童时便开始因不能顺利排痰而逐步出现肺部感染和支气管扩张，最后往往导致肺功能衰竭，这种病人后期常伴有绿脓杆菌在肺部大量积存并常常引起感染。ANCA在CF病人中广泛存在，其特异性靶抗原至今仅发现一种，即BPI。成人CF中91%的血清含有IgG型抗BPI抗体，83%含有IgA型。IIF法检测可表现为微弱均质颗粒状的胞浆型ANCA，也可称之为非典型ANCA。抗BPI抗体滴度可高达1:12,800，更为重要的是抗体(特别是IgA型)的阳性率和患者肺功能的下降成正相关。研究显示，细菌感染可能与抗BPI抗体的产生有关，抗BPI自身抗体可参与肺损伤和肺外血管炎的发生。东方人CF较少见，但东方人有和CF相似的一类疾病，称之为弥漫性全小支气管炎(diffuse pan-brochiolitis, DPB )，该病也常继发绿脓杆菌感染。在一项研究中，11例日本的DPB患者血清中，6例含有IgG和域 IgA型抗BPI抗体，也支持了上述观点。国内孙奇志等发现在慢性支气管炎，特别是合并肺部绿脓杆菌感染的患者中可以检测到滴度较高的抗BPI抗体。   
      研究报道寄生虫感染也可以出现ANCA阳性，溶组织阿米巴病人可有cANCA，并认为其靶抗原为PR3，但尚未得到进一步证实。最近关于慢性高反应性盘尾丝虫病(chronic hyperreactive onchocerciasis)和ANCA的关系引起了人们的重视。这种寄生虫感染可见于热带，是中美洲地区的流行病。该病也可以有血管炎、肉芽肿形成，在一组研究中所有35例病人均ANCA阳性，且其靶抗原被证明为人中性粒细胞嗜天青颗粒中的防御素(defensins) 。
      病毒感染性疾病也可以引起ANCA阳性，如HIV阳性患者血清可以产生ANCA.   
9 }' U' E  p6 n) ]5 R; V& ~      ANCA在感染性疾病中阳性提示感染可能是产生ANCA的病因之一。                                   
                                                                                                                                                                  (赵明辉)
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