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发表于 2008-12-16 13:48:26
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21-3-第三节 诊断系统性红斑狼疮的自身杭体
研究发现ANA的特定核型对于诊断SLE、干燥综合征、多发性肌炎/皮肌炎、硬皮病、原发性胆汁性肝硬化及其他系统性自身免疫病具有特异性,这一发现是系统性自身免疫病诊断的主要进展。这些临床上有用的自身抗体可以用免疫双扩散法、ELISA、免疫印迹法和免疫沉淀法来检测。近来报道已发现了类风湿关节炎的特异性自身抗体。许多抗原是由蛋白和核酸组成的多成分的复合物。下面所讨论的是扩大了ANA检测意义的多种自身抗体系统。这些自身抗体(表21-2)被广泛应用于自身免疫病的血清学诊断。用于诊断狼疮的自身抗体包括抗DNA抗体、抗Sm抗体、抗核糖体P抗体以及抗增殖细胞核抗原抗体。
; ^% W! `* t3 c. d; O 一、抗DNA、组蛋白和核小体的抗体
* b. I0 y Q# i! g" W/ L& G 核小体是由DNA和组蛋白组成的复合物,是被首先发现的狼疮自身抗原。抗核小体抗体的其中一个亚群与狼疮细胞现象有关。产生抗核小体组分(DNA、组蛋白及DNA-组蛋白复合物)的自身抗体是狼疮自身免疫反应的重要组成部分,同时也是普鲁卡因酰胺、肼苯哒嗪、奎尼丁、异烟肼等药物诱导的狼疮样综合征的特征性表现。' K9 t4 s8 r: ~
1.抗原 + g3 ~( _7 z& C7 s
DNA被组装到组蛋白复合物上,这一复合物由145个碱基对组成的双链DNA缠绕组蛋白核心八聚体构成,此八聚体含有H2A/H2B,H3和H4各两分子。每一个单位称为一个核小体。与组蛋白H1关联的连接 DNA (linker DNA)将任意两个核小体连接在一起。在这样一个结构中,DNA链类似串在绳上的珠子。 S5 O8 K& D* _, P0 n! a6 \/ U. D
2.抗核小体、抗组蛋白、抗单链DNA抗体 $ A( F; J. r0 W1 }% e
尽管在狼疮患者核小体是自身抗体的主要作用目标,但抗核小体抗体在SLE并不特异,它也可见于药物诱导性狼疮和其他系统性自身免疫病。该抗体主要的靶抗原是H2A- H2B -DNA复合物。抗核小体抗体与ANA荧光检测的均质型(彩图21一3A)相关。针对H2A- H2B -DNA复合物产生的自身抗体可用ELISA法检测。在服用普鲁卡因酰胺、肼苯哒嗪、奎尼丁、甲基多巴、氯丙嗪、异烟肼、呋喃妥因或美满霉素等药物的患者中,检测到针对H2A- H2B -DNA复合物产生的IgG型自身抗体,这与药物诱导性狼疮的诊断相关。另外,还有其他药物可能与狼疮样综合征有关,但较少见。针对H2A- H2B -DNA复合物产生的IgG型自身抗体对诊断普鲁卡因酰胺诱导性狼疮的敏感性为84%,且在出现症状前1年即可出现抗体滴度的显著增高。针对组蛋白和单链DNA所产生的抗体也与药物诱导性狼疮相关。与抗核小体抗体一样,它们也可见于系统性自身免疫病(如狼疮、硬皮病、多发性肌炎)中。; y* _5 n, P9 ?7 M
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$ t9 _0 _0 a2 M$ c 有趣的是,多数药物诱导性狼疮患者在停用引发该病的药物后,抗核小体抗体、抗组蛋白抗体和抗单链DNA抗体会消失。同样有趣的是,尽管SLE和药物诱导性狼疮均与抗核小体抗体相关,但很少有证据显示诸如普鲁卡因酰胺或肼苯哒嗪等药物会促进SLE患者产生这些自身抗体。因此,SLE患者应用与药物诱导性狼疮相关的药物一般来说是安全的。 " i& d% s3 Q' R, C
3.抗双链(ds) DNA抗体
+ {% H. ^: g3 V( U. O 70%的狼疮患者在其疾病的某些阶段都会出现抗dsDNA抗体。它对于诊断狼疮的特异性为95% ,因此有很高的诊断价值。从狼疮患者的肾小球免疫沉积物中可洗脱出抗dsDNA抗体,这表明包含抗DNA抗体的免疫复合物具有致病性。其致病性主要有以下三种假说:①所形成的DNA-抗DNA免疫复合物可沉积在肾小球基底膜上引起炎症反应; ②DNA或核小体可以在肾小球基底膜上与抗-DNA抗体原位结合;③抗DNA抗体的一个亚型可能与内源性肾小球抗原发生交叉反应。
/ ]- ?# `7 f3 e& g4 M7 b& I 与免疫复合物介导的狼疮发病相一致,抗dsDNA抗体与免疫复合物的水平通常是相反的,即在狼疮加重期表现为高水平的抗dsDNA抗体和低水平的免疫复合物,而在狼疮缓解期则恰好相反。但是,有的无症状患者也会有持续高水平的抗dsDNA抗体。将特定的单克隆抗ds或ssDNA抗体注射给小鼠可以诱发肾脏疾病,但并非所有的情况都这样。对可导致狼疮性肾炎的坑dsDNA抗体的特征尚不明确,与肾脏内源性抗原发生交叉反应是其中一种可能的机制,免疫复合物的有效沉积可能也很重要。致病性也可能与DNA的亲和力高低有关。" s. I6 n( Q" j1 }$ v
4.抗dsDNA抗体的检测 + f: o% n# U3 Q" d2 |$ n. \& D0 c: I
抗dsDNA抗体的检测包括放射免疫法(Farr法)、微孔滤膜分析、聚乙二醇(PEG)分析、绿蝇短膜虫动基体-染色分析和酶联免疫吸附法(ELISA)。区别抗单链或双链 DNA抗体很重要,因为只有后者才与疾病活动密切相关。有两种方法可用来确认特异性的dsDNA,一种是用 Sl核酸酶处理或用羟磷灰石吸附以去除单链DNA,另外可应用闭合的环状DNA(这种DNA无末端,故打不开)。后者是绿蝇短膜虫动基体-染色分析的基础,虫体内含有闭合的环状动基体,可与血清中抗dsDNA抗体结合,并用FITC标记的羊抗人Ig抗体检测。
7 g+ [2 _9 l" h 5.抗dsDNA抗体监测疾病的活动性
+ N/ ]% M/ c& N/ k: L% Z, p/ ^4 @6 x 应用抗dsDNA抗体监测狼疮疾病的活动性尚有争议。用 Farr法检测到高亲和力的抗DNA抗体可能比像ELISA法检测到的低亲和力抗体更有提示疾病活动的意义。Farr法可比临床表现早10周预测疾病的复发。有人认为对抗dsDNA抗体的预测可能有助于临床的诊治,并提议一旦Farr法检测发现抗dsDNA抗体水平显著上升,即给予泼尼松治疗。这一方法值得进一步探讨,但仍有争议。
% D* B0 h: `. S, U3 a 二、抗Sm抗体和抗nRNP抗体
D8 i* Z6 j& Y" |! j0 R 取决于种族的不同,狼疮患者抗 Sm抗体阳性率在7%~30% (图21一5)。与抗dsDNA抗体一样,这一抗体也是SLE的特异性抗体(表21一2,3)。抗nRNP抗体与抗Sm抗体密切相关,但无疾病特异性,因此这种抗体在诊断SLE或预测其病程方面的应用有限。抗 nRNP抗体阳性见于不到15%的SLE患者。抗Sm抗体和抗nRNP抗体在各种族狼疮患者的阳性率有很大差异,如在非洲裔美国人中最高,中国人中等,白人最低(图21一5)。与抗DNA抗体相反,很少有证据表明抗nRNP或抗 Sm抗体会直接致病。' J$ W, u5 R# G$ C; o" P/ O6 L
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1. Sm和nRNP抗原
& Q7 O: W4 j; h* M0 ^+ C 抗Sm和抗nRNP抗体识别U1小核糖核蛋白颗粒的不同蛋白组分。抗原包括与单个U1小核RNA分子相关的蛋白Ul-70K(70kD),A(33kD),B’/B(分别为29kD和28 kD),C(23kD),Dl/2/3(16 kD),E(12 kD),F(11 kD)和G(10 kD)(图21一6A)。蛋白B’/B, D,E,F,G装配成一个稳定的6S的Sm“核心颗粒”,与抗Sm抗体发生反应,但不与抗 nRNP抗体反应。X线晶体图像研究提示 Sm核心颗粒形成一个闭合的环,U1RNA分子穿过此炸面饼圈样结构(doughnut-like structure)中带正电的孔。U1-A和Ul-70K蛋白通过RNA识别基序与Ul RNA直接发生相互作用,而有赖RNA的Ul-C和U1小核糖核蛋白的联系,则经由与Sm核心颗粒中的B’/B组分的相互作用介导的。除了U1小核糖核蛋白以外,由独特的富含尿嘧啶核苷(U)的RNA和独特的蛋白组成的其他核糖核蛋白也具有Sm核心颗粒。它们包含丰富的U2,U4/U6以及U5小核糖核蛋白。
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- v" ^" L' P/ m& C6 O+ ~2 z 患者血清中的自身抗体使人们有可能确定U1,U2, U4-6和U5 snRNPs在剪切核内异质前体RNA成mRNA中的重要作用。在剪接过程中,小的U核糖核蛋白和其他蛋白组装成称之为剪接体的一个较大的结构,它介导内含子一外显子连接处序列的识别,切割间插序列,以及再拼接成熟的mRNA。每个剪接体是形成与抗nRNP或抗Sm抗体相关的细小荧光斑点核型的主要原因(彩图21一3B) 。
! a5 d ^: p& H2 ?4 z- B: C: r( V 2.抗nRNP抗体和抗Sm抗体同时出现
, w( m, ?& J! F6 V 几乎所有抗Sm抗体阳性的血清中都含有抗nRNP抗体,这被称为“连接组合”(linked set)。自身免疫病患者血清中的抗nRNP抗体水平通常远远超过抗Sm抗体的水平。大多数含有Ul snRNP抗体的血清可识别多种多肽。一项研究发现,在29份抗nRNP或抗Sm抗体阳性的血清中,用免疫印迹法测定,只有 1份仅识别一种蛋白,而绝大多数可识别3种或更多种蛋白,如Ul-70K, Ul-A, Ul-C和Sm-B’/B,Sm-D及Sm-E 。- k( f6 l" W' U# Z
有些自身抗体仅对表达于天然抗原的抗原表位是特异的,如抗天然的Ul-C抗体或抗由E,F,G Sm多肽联合形成的表位的抗体。也有报道,有的自身抗体可以稳定Ul-C蛋白和Sm核心颗粒或Ul-A蛋白和Sm核心颗粒之间的相互作用。
0 ~& C1 p0 t! O1 N( U* S U1小RNA分子也可被自身抗体识别。针对Ul RNA所产生的自身抗体可见于40%抗 nRNP/Sm抗体阳性的血清中,尽管最初认为这并不常见。它们识别的是Ul RNA中茎-环II的茎和茎-环IV的环结构(图21-6A)。有趣的是,它们仅与Ul RNA发生作用,尽管Ul RNA的茎-环II与U2 RNA的第四环仅有几个核苷酸的差别。对Ul RNA分子产生的自身抗体与抗nRNP抗体相关,它不出现于抗Sm抗体阳性的血清中,但可在nRNP抗体阳性血清中出现。+ `* ] Q/ w6 d# K* u) ?! P
3.临床意义
& [+ h! a9 t! {3 J& o 抗Sm抗体几乎只出现于SLE,而抗nRNP抗体则不同,它可见于SLE、硬皮病、多肌炎以及其他系统性自身免疫病。高滴度抗nRNP抗体且抗Sm抗体阴性是混合性结缔组织病的特征。抗Sm抗体和抗dsDNA抗体的高度特异性使它们成为SLE诊断标准中的一部分。 抗Sm抗体的阳性率在不同种族差异很大:欧洲人阳性率不足10%,而非洲裔美洲人的阳性率为 25%~30%,中国人则在两者之间。尽管有报道抗Sm抗体存在于狼疮并发的脑器质综合征、精神分裂症及葡萄膜炎等其他疾病中,但这只是用 ELISA法检测所得的结果,未用免疫双扩散或免疫沉淀等更为特异的方法进行验证。因此,抗Sm抗体与其他疾病的关系尚未经证实。另有报道,抗Sm抗体可能与雷诺现象的发生率增高以及轻型肾脏或中枢神经系统疾病相关,但这也有待于证实。尽管不像抗DNA抗体水平变化那样明显,但抗Sm抗体或抗nRNP抗体也可能反映疾病的活动度。抗Ul RNA抗体的水平也与疾病活动相平行,它也许是有用的临床指标。另外,抗Sm抗体和抗nRNP抗体一旦出现一般会保持一个相对恒定的水平,而且与抗DNA抗体不同,它们不会在疾病的静止期消失。
9 r: c7 J" S5 R# @# Y3 R 4.抗Sm抗体和抗nRNP抗体的检测
8 V+ k: z; K7 A1 y( V3 f( X 免疫沉淀法是检测抗Sm抗体和抗nRNP抗体的金标准(gold standard),但这种方法技术要求高,要应用放射性同位素,故没有被广泛采用。在这种情况下,临床上检测这两种抗体很大程度还依靠免疫双扩散法、对流免疫电泳法和ELISA法。然而这几种方法都有其不足之处。免疫双扩散法特异性高,操作简单,无需特殊仪器或纯化的抗原,但它的敏感性相对较低。目前,免疫双扩散法和敏感性较高的对流免疫电泳法可能是常规检测抗Sm抗体和抗nRNP抗体最可靠的方法。如果实施标准化检测,ELISA法也能提供有价值的结果,该方法需要高度纯化的抗原,最好能用生化提纯的完整的抗原复合物或单一的重组蛋白。与ELISA法检测抗DNA抗体的情况一样,意义不确定的低亲和力抗体也可能呈现阳性。
, }) R* S i! c# o6 Q6 C+ o6 H" ~, F! Q 三、抗核糖体抗体
3 n9 B0 @ w y6 w' R3 P' R) Z 抗核糖体抗体也是诊断SLE的高度特异性抗体。 - |: \* k# n# k
1.抗原
9 h7 F2 C4 X( Y6 q8 V2 V+ I 核糖体是胞浆中蛋白质合成的分子工厂(彩图21一3C)。它由一个40S和一个 60S的亚单位构成,共包含大约80种蛋白质和4种RNA分子。最常见的抗核糖体抗体识别的是60S亚单位上的三个大小约为38,19,17 kD的磷酸化的蛋白(P0、P1和 P2)。抗 P抗体识别P0、P1和P2蛋白C末端保守的抗原决定簇。其他如S10蛋白、L5蛋白、L12蛋白等核糖体蛋白质以及28S的RNA分子也都是自身抗原。- A. Q- k# ]' A5 D, g/ ?1 @
2.临床意义
1 m, x9 T H4 w+ U/ S 抗核糖体蛋白质 P0、 P1和P2的抗体对SLE高度特异,但敏感性不及抗Sm抗体和抗dsDNA抗体,其阳性率为3%~15%(彩图21一3)。能被狼疮患者血清识别的最主要的抗原决定簇存在于这些蛋白质C端的22个氨基酸中。抗P抗体被认为与神经精神症状特别是狼疮性精神病相关,其水平的高低可预测疾病的复发。然而,这些自身抗体与狼疮精神神经症状之间的关系仍存在争论。
$ {( F5 k' T& O 3.抗核糖体抗体的检测 0 W# k+ h. D( I1 [( m/ `* O' |
抗核糖体P抗体可用免疫沉淀法和免疫扩散法进行测定。也有用人P2蛋白的C末端肽作抗原进行ELISA法和免疫印迹法检测。5 l4 Y' U; b/ [. |+ L
四、抗增殖细胞核抗原(PCNA)抗体
5 [* e7 [* @* q1 ~. F6 _ 抗增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)是一个36kD的蛋白质。用甲醇固定该抗原进行免疫荧光检测,胞核染色的结果变异较大。PCNA是DNA多聚酶δ的辅助因子。由于从增殖期和静止期(Go)的细胞核中提取的PCNA不同,增殖期细胞的核可以被染色,而静止期的则不被染色。如用福尔马林固定,则细胞周期中所有时相的细胞都可被染色。抗PCNA抗体不常见,但它对SLE高度特异,其阳性率为1%~5%(见彩图21一3)。因为阳性率太低,目前尚没有它对诊断SLE特异性的准确数据,但几乎所有该抗体的报道都是关于SLE患者的。回顾性研究提示其滴度与疾病活动性相关,但仍需进一步研究证实。这种抗体的检测方法有免疫双扩散法、对流免疫电泳法和免疫沉淀法。 |
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