21-第21章 抗核抗体:系统性有身免疫病的诊断和预后评价指标

可乐加水

抗核抗体首次发现于1957年，而狼疮细胞现象(多形核细胞吞噬了相对完整的核物质)早在1948年就已被描述。在之后的半个世纪里，多种抗细胞核及抗细胞浆成分的抗体被相继发现，这些抗体对系统性自身免疫病的诊断和预后判断有着非常重要的意义。本章提供了理解SLE患者体液免疫反应的概念性框架，同时介绍了抗核抗体在系统性自身免疫病的诊断和治疗方面的实际应用。
, ~. b1 g/ s1 e# w6 K; c5 M! ]- E  R
目录：
2 [# e% V: t4 F7 @
2 a7 M# o4 K: t第一节 自身免疫病和自身抗体
1 }: \) P3 L1 t6 r* [7 w5 t
# c6 a4 W, [2 p) a0 H- R# j第二节 抗核抗体

- Q9 V/ y" l+ n* L- F+ O# {( F第三节 诊断系统性红斑狼疮的自身抗体
" P' s+ |5 u' z' n' l
第四节 诊断干燥综合征的自身抗体
$ V% \" O5 s% e3 l: S7 M. f
第五节 诊断硬皮病的自身抗体
) X. U2 j5 v7 E; a( ^
! c% m& L; i5 I% K第六节 诊断肌炎的自身抗体

! i- T! n3 f- [; n第七节 无症状个体中与疾病相关的自身抗体

1 N: |& P! k) N) @4 ?  `" ^2 n第八节 自身抗体的实验室检测

第九节 ANA阳性的评价

. o! @" q% `& y* ~  g第十节 抗核抗体的致病机制

' X0 x6 f0 R1 m/ D+ k第十一节 小 结

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自身免疫病是以对自身抗原产生异常免疫应答从而引起严重的慢性疾病为特征的疾病。描述这些疾病在中国的发病率和治疗费用等方面的资料非常少，相关的数据在美国也不全面。美国大约有1000万人罹患自身免疫病(占美国总人口的3%)，其中近75%的患者为女性。自身免疫病是65岁以下女性前10位的死因之一。自身免疫病几乎可以累及任何器官，有时也可为单一器官受累，如甲状腺。在诸如RA、SLE、系统性硬化、多发性肌炎/皮肌炎和干燥综合征等系统性自身免疫病中，可有多种脏器受累。这些疾病的治疗费用相当可观，以美国为例，全美有210万 RA患者(女性150万，男性60万)，每人每年的直接医疗费用和间接费用(如误工)约为6000美金;另外，美国SLE患者达50万，每人大约花费 13000美金，按此计算美国每年有近65亿美金的经济支出用于这些患者。干燥综合征在美国和中国人群中的患病率不到 1%，本病所造成的经济影响鲜有资料报道。  
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      性别、遗传和环境的重要性:系统性自身疫病是以女性发病为主的疾病，例如，类风湿关节炎女性与男性发病之比为3:1，而系统性红斑狼疮在15～45岁之间女性与男性之比为9:1。尽管资料尚不全面，不过研究发现SLE似乎更好发于非洲裔美国人、本土美国人、西班牙语系人及亚洲人，而白人较少发病。非洲裔美国人SLE和系统性硬化(硬皮病)患者在诊断时的年龄要比其他人群早7年。黑人SLE患者的病情往往比白种人重，特别是严重狼疮性肾炎的发病率高于白种人，这可能部分反映了Fc受体基因的多态性。狼疮在亚洲人中也较常见，且可能较严重。例如在夏威夷，SLE在中国人、菲律宾人、混血夏威夷人和日本人中比白人更常见(图21一1A)。夏威夷的非白种人(亚裔人)比白种人的死亡率也更高(图21一1B)。目前尚不清楚上述差别是否反映了遗传背景、享受医疗保健的程度以及环境的不同。   

      目前已经明矶，遗传因素在决定疾病的易感性方面起到了重要作用，这在孪生子研究以及全基因组扫描中都已得到证实。狼疮易感F1子代小鼠(NZB*NZW)有 10个或更多个狼疮易感位点，在人类也许有相同的情况。环境因素也很重要，比如，部分患者最初是由紫外线诱发起病的即可说明这一点。也许社会经济状况也是疾病严重程度和预后的决定因素之一，不过对于这一点尚有争议。特定的碳氢化合物如异十八烷可诱发鼠的狼疮样综合征，这进一步证实了环境因素的作用。这些因素如何触发疾病或使疾病加重尚不清楚。

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许多系统性自身免疫病可产生自身抗体。在狼疮主要是直接针对核抗原产生的抗体，当然也有其他抗体存在。抗核抗体(ANA)的荧光分析操作简单并具有很高的敏感性，95%以上的SLE患者均为阳性。它检测的是血清中抗核成分和抗胞浆成分的抗体。虽然最初应用鼠肝或肾切片作底物，但是人贴壁细胞系的HEp-2（人喉癌）细胞是最适合的底物。图21-2描述了进行荧光ANA分析的步骤:将细胞置于显微镜载玻片上，用甲醇固定并使细胞的通透性增高，然后用人血清进行孵育。在进行下一个步骤之前洗涤玻片，以去除未结合的抗体，然后用荧光素(异硫氰酸荧光系)标记的抗免疫球蛋白抗体孵育。将载玻片置于荧光显微镜下，观察用不同稀释倍数的血清孵育下胞核和胞浆荧光染色的强度及核型。不同类型的自身抗体产生不同的荧光核型。
9 _! z7 _7 r8 b! w. e  g6 B% s      抗核抗体检测通常是免疫诊断(immunodiagnosis)诸如SLE等系统性自身免疫病的第一步。尽管免疫荧光法是标准方法，但是选择ELISA等其他方法更易于实施自动化检测，不过后者的结果可能不够精确。

% {2 K" l7 b. A% w      1. ANA免疫荧光检测   
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      彩图21一3 (A～F)是ANA免疫荧光检测得到的一些典型染色核型(均质型、斑点型、胞浆型、着丝点型、核仁型)，其他核型比较少见。核型的不同反映了标本血清中存在针对不同核抗原的自身抗体。核仁型(彩图21一3E)提示诊断硬皮病;着丝点型(彩图21一3D)与局限性硬皮病相关，尤其是与该病的一个亚型CREST综合征(钙化、雷诺现象、食管运动功能障碍、指端硬化、毛细血管扩张)相关;均质型和斑点型(彩图 21一3A, B)诊断疾病的特异性较低。ANA免疫荧光技术也可用于检测与胞浆抗原发生反应的自身抗体，如抗核糖体P抗体(彩图21一3C)、抗信号识别颗粒抗体(彩图21一3F)、抗组氨酰t RNA合成酶抗体(Jo-1)以及抗线粒体抗体。  
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- m% [7 r; E9 s7 J' r$ @      2 . ANA免疫荧光检测的敏感性和特异性   

+ \5 n, O& j; N      用人HEp-2细胞作底物，ANA阳性诊断SLE的敏感性是90%～98%。事实上，几乎100%的硬皮病患者ANA为阳性。干燥综合征、多发性肌炎/皮肌炎的ANA阳性率也很高。与其高度的敏感性相反，ANA阳性对于狼疮诊断的特异性相对较低，其阳性预测值仅为11%～13%。一项来自澳大利亚的研究发现，18.8%ANA阳性者为SLE,10 . 9%为药物性狼疮，21.7%为其他系统性自身免疫病(如干燥综合征、肌炎、硬皮病),10.1%为自身免疫性甲状腺炎，5.8%为器官特异性自身免疫病，8.3%为感染，2.9%为肿瘤,24.3%为其他情况或特发性自身抗体。需注意的是，一些健康人也可出现低滴度的ANA。在随机抽取的健康白种人中，ANA的阳性率为 3%～5%。 ANA的出现与年龄有很强的相关性，年龄在65岁以上的健康人ANA阳性率可升至 10%～37%。尽管ANA在健康人中并不少见，但其滴度一般在 1:160以下。曾有报道，在滴度为 1:320时，正常人ANA的阳性率为3.3%，而在滴度为1:40时，其值将升至31.7%(图21一4)。总之，对于诊断SLE, ANA检测的阳性预测值较低;相反地，如患者ANA阴性，则患SLE的可能性低于3%。因此，尽管ANA对于确诊SLE有一定的局限性，但ANA阴性有助于排除狼疮诊断。

      3 . ANA免疫荧光染色的解释   

2 `; z! O) z* U/ O. v      能否正确解释ANA免疫荧光的染色结果有赖于观察者，故需对他们进行训练。即使经过训练的观察者，也存在实验室之间的差异。在一项研究中发现，当稀释度为1 320时，实验室之间的变异系数为36% ，而稀释度为1:40时，则为51%。尽管如此，在大多数情况下，这一检测仍可将正常人与SLE、硬皮病或干燥综合征等区别开来。在血清稀释度为1 : 160时，其敏感性和特异性可达最佳值。在这一稀释度，各疾病分类的正确率分别为SLE 95 %、硬皮病87%、干燥综合征74%。另外，95%的健康对照可被正确地鉴定出来。因此同时报告血清稀释度为1:160和1:40时的ANA检测结果可能会有一定的价值。
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6 M$ `1 W& h/ \. Q* V  b) G       4. ELISA法检测ANA  

7 k& l4 e' i/ {2 I# n! d! B      为减少投入参与ANA免疫荧光检测的人力，正逐渐发展出自动检测ANA的ELISA法。这一方法利用核抗原粗提物或与狼疮或其他疾病相关的自身抗体识别的纯化抗原的混合物作为抗原。应用核抗原粗提物有一弱点，即不易监测每种抗原与塑料孔壁的结合，而且那些不能溶解的核抗原如核纤层蛋白A,B,C在提取过程中会被丢失，因而无法制备。DNA与细胞壁的结合也是不恒定的。应用核抗原粗提物的另一缺点是不能获得 ANA核型所提供的信息。在对六种 ELISA法与荧光抗核抗体(FANA)进行的一项比较中发现检测结果有本质的差别，当然也有一致性很好的报道。决定应用何种方法尚需进行进一步研究，根据目前的情况，尚不能废弃标准化但需大量人力的荧光ANA方法。

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研究发现ANA的特定核型对于诊断SLE、干燥综合征、多发性肌炎/皮肌炎、硬皮病、原发性胆汁性肝硬化及其他系统性自身免疫病具有特异性，这一发现是系统性自身免疫病诊断的主要进展。这些临床上有用的自身抗体可以用免疫双扩散法、ELISA、免疫印迹法和免疫沉淀法来检测。近来报道已发现了类风湿关节炎的特异性自身抗体。许多抗原是由蛋白和核酸组成的多成分的复合物。下面所讨论的是扩大了ANA检测意义的多种自身抗体系统。这些自身抗体(表21-2)被广泛应用于自身免疫病的血清学诊断。用于诊断狼疮的自身抗体包括抗DNA抗体、抗Sm抗体、抗核糖体P抗体以及抗增殖细胞核抗原抗体。
   一、抗DNA、组蛋白和核小体的抗体   
      核小体是由DNA和组蛋白组成的复合物，是被首先发现的狼疮自身抗原。抗核小体抗体的其中一个亚群与狼疮细胞现象有关。产生抗核小体组分(DNA、组蛋白及DNA-组蛋白复合物)的自身抗体是狼疮自身免疫反应的重要组成部分，同时也是普鲁卡因酰胺、肼苯哒嗪、奎尼丁、异烟肼等药物诱导的狼疮样综合征的特征性表现。
2 b: t' |" B1 p0 C      1.抗原   
      DNA被组装到组蛋白复合物上，这一复合物由145个碱基对组成的双链DNA缠绕组蛋白核心八聚体构成，此八聚体含有H2A/H2B,H3和H4各两分子。每一个单位称为一个核小体。与组蛋白H1关联的连接 DNA (linker DNA)将任意两个核小体连接在一起。在这样一个结构中，DNA链类似串在绳上的珠子。   
      2.抗核小体、抗组蛋白、抗单链DNA抗体   
* M4 Q7 k2 x' H3 U; s$ K- ?9 U1 M      尽管在狼疮患者核小体是自身抗体的主要作用目标，但抗核小体抗体在SLE并不特异，它也可见于药物诱导性狼疮和其他系统性自身免疫病。该抗体主要的靶抗原是H2A- H2B -DNA复合物。抗核小体抗体与ANA荧光检测的均质型(彩图21一3A)相关。针对H2A- H2B -DNA复合物产生的自身抗体可用ELISA法检测。在服用普鲁卡因酰胺、肼苯哒嗪、奎尼丁、甲基多巴、氯丙嗪、异烟肼、呋喃妥因或美满霉素等药物的患者中，检测到针对H2A- H2B -DNA复合物产生的IgG型自身抗体，这与药物诱导性狼疮的诊断相关。另外，还有其他药物可能与狼疮样综合征有关，但较少见。针对H2A- H2B -DNA复合物产生的IgG型自身抗体对诊断普鲁卡因酰胺诱导性狼疮的敏感性为84%，且在出现症状前1年即可出现抗体滴度的显著增高。针对组蛋白和单链DNA所产生的抗体也与药物诱导性狼疮相关。与抗核小体抗体一样，它们也可见于系统性自身免疫病(如狼疮、硬皮病、多发性肌炎)中。
- _) M6 [# E% ]   
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+ P4 q1 x2 w. t. r      有趣的是，多数药物诱导性狼疮患者在停用引发该病的药物后，抗核小体抗体、抗组蛋白抗体和抗单链DNA抗体会消失。同样有趣的是，尽管SLE和药物诱导性狼疮均与抗核小体抗体相关，但很少有证据显示诸如普鲁卡因酰胺或肼苯哒嗪等药物会促进SLE患者产生这些自身抗体。因此，SLE患者应用与药物诱导性狼疮相关的药物一般来说是安全的。   
      3.抗双链(ds) DNA抗体   
      70%的狼疮患者在其疾病的某些阶段都会出现抗dsDNA抗体。它对于诊断狼疮的特异性为95% ，因此有很高的诊断价值。从狼疮患者的肾小球免疫沉积物中可洗脱出抗dsDNA抗体，这表明包含抗DNA抗体的免疫复合物具有致病性。其致病性主要有以下三种假说:①所形成的DNA-抗DNA免疫复合物可沉积在肾小球基底膜上引起炎症反应; ②DNA或核小体可以在肾小球基底膜上与抗-DNA抗体原位结合;③抗DNA抗体的一个亚型可能与内源性肾小球抗原发生交叉反应。   
- N" k5 r1 F6 K      与免疫复合物介导的狼疮发病相一致，抗dsDNA抗体与免疫复合物的水平通常是相反的，即在狼疮加重期表现为高水平的抗dsDNA抗体和低水平的免疫复合物，而在狼疮缓解期则恰好相反。但是，有的无症状患者也会有持续高水平的抗dsDNA抗体。将特定的单克隆抗ds或ssDNA抗体注射给小鼠可以诱发肾脏疾病，但并非所有的情况都这样。对可导致狼疮性肾炎的坑dsDNA抗体的特征尚不明确，与肾脏内源性抗原发生交叉反应是其中一种可能的机制，免疫复合物的有效沉积可能也很重要。致病性也可能与DNA的亲和力高低有关。
      4.抗dsDNA抗体的检测   
      抗dsDNA抗体的检测包括放射免疫法(Farr法)、微孔滤膜分析、聚乙二醇(PEG)分析、绿蝇短膜虫动基体-染色分析和酶联免疫吸附法(ELISA)。区别抗单链或双链 DNA抗体很重要，因为只有后者才与疾病活动密切相关。有两种方法可用来确认特异性的dsDNA,一种是用 Sl核酸酶处理或用羟磷灰石吸附以去除单链DNA，另外可应用闭合的环状DNA(这种DNA无末端，故打不开)。后者是绿蝇短膜虫动基体-染色分析的基础，虫体内含有闭合的环状动基体，可与血清中抗dsDNA抗体结合，并用FITC标记的羊抗人Ig抗体检测。   
       5.抗dsDNA抗体监测疾病的活动性   
      应用抗dsDNA抗体监测狼疮疾病的活动性尚有争议。用 Farr法检测到高亲和力的抗DNA抗体可能比像ELISA法检测到的低亲和力抗体更有提示疾病活动的意义。Farr法可比临床表现早10周预测疾病的复发。有人认为对抗dsDNA抗体的预测可能有助于临床的诊治，并提议一旦Farr法检测发现抗dsDNA抗体水平显著上升，即给予泼尼松治疗。这一方法值得进一步探讨，但仍有争议。
& s- @6 k+ N+ ~   二、抗Sm抗体和抗nRNP抗体   
* Y. @: ?) A8 |( E' x9 k8 ^      取决于种族的不同，狼疮患者抗 Sm抗体阳性率在7%～30% (图21一5)。与抗dsDNA抗体一样，这一抗体也是SLE的特异性抗体(表21一2,3)。抗nRNP抗体与抗Sm抗体密切相关，但无疾病特异性，因此这种抗体在诊断SLE或预测其病程方面的应用有限。抗 nRNP抗体阳性见于不到15%的SLE患者。抗Sm抗体和抗nRNP抗体在各种族狼疮患者的阳性率有很大差异，如在非洲裔美国人中最高，中国人中等，白人最低(图21一5)。与抗DNA抗体相反，很少有证据表明抗nRNP或抗 Sm抗体会直接致病。
        
      1. Sm和nRNP抗原   
, p$ j% }) K" ]" R       抗Sm和抗nRNP抗体识别U1小核糖核蛋白颗粒的不同蛋白组分。抗原包括与单个U1小核RNA分子相关的蛋白Ul-70K(70kD),A(33kD),B’/B(分别为29kD和28 kD),C(23kD),Dl/2/3(16 kD),E(12 kD),F(11 kD)和G(10 kD)(图21一6A)。蛋白B’/B, D,E,F,G装配成一个稳定的6S的Sm“核心颗粒”，与抗Sm抗体发生反应，但不与抗 nRNP抗体反应。X线晶体图像研究提示 Sm核心颗粒形成一个闭合的环，U1RNA分子穿过此炸面饼圈样结构(doughnut-like structure)中带正电的孔。U1-A和Ul-70K蛋白通过RNA识别基序与Ul RNA直接发生相互作用，而有赖RNA的Ul-C和U1小核糖核蛋白的联系，则经由与Sm核心颗粒中的B’/B组分的相互作用介导的。除了U1小核糖核蛋白以外，由独特的富含尿嘧啶核苷(U)的RNA和独特的蛋白组成的其他核糖核蛋白也具有Sm核心颗粒。它们包含丰富的U2,U4/U6以及U5小核糖核蛋白。   
  
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$ j/ c+ ]' i0 Y6 h      患者血清中的自身抗体使人们有可能确定U1,U2, U4-6和U5 snRNPs在剪切核内异质前体RNA成mRNA中的重要作用。在剪接过程中，小的U核糖核蛋白和其他蛋白组装成称之为剪接体的一个较大的结构，它介导内含子一外显子连接处序列的识别，切割间插序列，以及再拼接成熟的mRNA。每个剪接体是形成与抗nRNP或抗Sm抗体相关的细小荧光斑点核型的主要原因(彩图21一3B) 。
0 N( U1 F0 x' y* `: J       2.抗nRNP抗体和抗Sm抗体同时出现   
       几乎所有抗Sm抗体阳性的血清中都含有抗nRNP抗体，这被称为“连接组合”(linked set)。自身免疫病患者血清中的抗nRNP抗体水平通常远远超过抗Sm抗体的水平。大多数含有Ul snRNP抗体的血清可识别多种多肽。一项研究发现，在29份抗nRNP或抗Sm抗体阳性的血清中，用免疫印迹法测定，只有 1份仅识别一种蛋白，而绝大多数可识别3种或更多种蛋白，如Ul-70K, Ul-A, Ul-C和Sm-B’/B,Sm-D及Sm-E 。
      有些自身抗体仅对表达于天然抗原的抗原表位是特异的，如抗天然的Ul-C抗体或抗由E,F,G Sm多肽联合形成的表位的抗体。也有报道，有的自身抗体可以稳定Ul-C蛋白和Sm核心颗粒或Ul-A蛋白和Sm核心颗粒之间的相互作用。   
5 W9 ?2 w# r& f  U" s      U1小RNA分子也可被自身抗体识别。针对Ul RNA所产生的自身抗体可见于40%抗 nRNP/Sm抗体阳性的血清中，尽管最初认为这并不常见。它们识别的是Ul RNA中茎-环II的茎和茎-环IV的环结构(图21-6A)。有趣的是，它们仅与Ul RNA发生作用，尽管Ul RNA的茎-环II与U2 RNA的第四环仅有几个核苷酸的差别。对Ul RNA分子产生的自身抗体与抗nRNP抗体相关，它不出现于抗Sm抗体阳性的血清中，但可在nRNP抗体阳性血清中出现。
, ?4 W# e9 U+ o& W7 `& \8 Z0 T      3.临床意义   
7 l  o3 F0 O2 p9 G# C0 ~1 X, ?      抗Sm抗体几乎只出现于SLE，而抗nRNP抗体则不同，它可见于SLE、硬皮病、多肌炎以及其他系统性自身免疫病。高滴度抗nRNP抗体且抗Sm抗体阴性是混合性结缔组织病的特征。抗Sm抗体和抗dsDNA抗体的高度特异性使它们成为SLE诊断标准中的一部分。    抗Sm抗体的阳性率在不同种族差异很大:欧洲人阳性率不足10%，而非洲裔美洲人的阳性率为 25%～30%，中国人则在两者之间。尽管有报道抗Sm抗体存在于狼疮并发的脑器质综合征、精神分裂症及葡萄膜炎等其他疾病中，但这只是用 ELISA法检测所得的结果，未用免疫双扩散或免疫沉淀等更为特异的方法进行验证。因此，抗Sm抗体与其他疾病的关系尚未经证实。另有报道，抗Sm抗体可能与雷诺现象的发生率增高以及轻型肾脏或中枢神经系统疾病相关，但这也有待于证实。尽管不像抗DNA抗体水平变化那样明显，但抗Sm抗体或抗nRNP抗体也可能反映疾病的活动度。抗Ul RNA抗体的水平也与疾病活动相平行，它也许是有用的临床指标。另外，抗Sm抗体和抗nRNP抗体一旦出现一般会保持一个相对恒定的水平，而且与抗DNA抗体不同，它们不会在疾病的静止期消失。   
      4.抗Sm抗体和抗nRNP抗体的检测   
. x" k9 G9 v& _- y' N, U; ?2 m      免疫沉淀法是检测抗Sm抗体和抗nRNP抗体的金标准(gold standard)，但这种方法技术要求高，要应用放射性同位素，故没有被广泛采用。在这种情况下，临床上检测这两种抗体很大程度还依靠免疫双扩散法、对流免疫电泳法和ELISA法。然而这几种方法都有其不足之处。免疫双扩散法特异性高，操作简单，无需特殊仪器或纯化的抗原，但它的敏感性相对较低。目前，免疫双扩散法和敏感性较高的对流免疫电泳法可能是常规检测抗Sm抗体和抗nRNP抗体最可靠的方法。如果实施标准化检测，ELISA法也能提供有价值的结果，该方法需要高度纯化的抗原，最好能用生化提纯的完整的抗原复合物或单一的重组蛋白。与ELISA法检测抗DNA抗体的情况一样，意义不确定的低亲和力抗体也可能呈现阳性。
   三、抗核糖体抗体   
" g8 \8 w! k/ D* Y: |# p      抗核糖体抗体也是诊断SLE的高度特异性抗体。  
      1.抗原   
      核糖体是胞浆中蛋白质合成的分子工厂(彩图21一3C)。它由一个40S和一个 60S的亚单位构成，共包含大约80种蛋白质和4种RNA分子。最常见的抗核糖体抗体识别的是60S亚单位上的三个大小约为38,19,17 kD的磷酸化的蛋白(P0、P1和 P2)。抗 P抗体识别P0、P1和P2蛋白C末端保守的抗原决定簇。其他如S10蛋白、L5蛋白、L12蛋白等核糖体蛋白质以及28S的RNA分子也都是自身抗原。
1 |: e4 J$ X& d0 J! \% T      2.临床意义   
! |( @. S, \& j# q1 K4 Y      抗核糖体蛋白质 P0、 P1和P2的抗体对SLE高度特异，但敏感性不及抗Sm抗体和抗dsDNA抗体，其阳性率为3%～15%(彩图21一3)。能被狼疮患者血清识别的最主要的抗原决定簇存在于这些蛋白质C端的22个氨基酸中。抗P抗体被认为与神经精神症状特别是狼疮性精神病相关，其水平的高低可预测疾病的复发。然而，这些自身抗体与狼疮精神神经症状之间的关系仍存在争论。   
      3.抗核糖体抗体的检测   
      抗核糖体P抗体可用免疫沉淀法和免疫扩散法进行测定。也有用人P2蛋白的C末端肽作抗原进行ELISA法和免疫印迹法检测。
   四、抗增殖细胞核抗原(PCNA)抗体
      抗增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)是一个36kD的蛋白质。用甲醇固定该抗原进行免疫荧光检测，胞核染色的结果变异较大。PCNA是DNA多聚酶δ的辅助因子。由于从增殖期和静止期(Go)的细胞核中提取的PCNA不同，增殖期细胞的核可以被染色，而静止期的则不被染色。如用福尔马林固定，则细胞周期中所有时相的细胞都可被染色。抗PCNA抗体不常见，但它对SLE高度特异，其阳性率为1%~5%(见彩图21一3)。因为阳性率太低，目前尚没有它对诊断SLE特异性的准确数据，但几乎所有该抗体的报道都是关于SLE患者的。回顾性研究提示其滴度与疾病活动性相关，但仍需进一步研究证实。这种抗体的检测方法有免疫双扩散法、对流免疫电泳法和免疫沉淀法。

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已经报道有很多自身抗体与原发或继发性干燥综合征有关，其中包括抗Ro(SS-A)抗体、抗La抗体(SS-B)，以及抗毒覃碱受体(muscarinic receptors)抗体、抗α-包衬蛋白(α-fodrin )抗体。就目前而言，只有抗Ro抗体和抗La抗体被广泛应用于干燥综合征的诊断(表21一2)。抗毒覃碱受体抗体的检测因技术要求很高而不易在临床进行，而抗α-包衬蛋白抗体的临床应用尚存在争议。故本章主要介绍抗 Ro(SS-A)抗体和抗La (SS-B)抗体。
$ X/ |0 x$ X+ i0 F! J      抗Ro (SS-A)抗体和抗La (SS-B)抗体是和原发性干燥综合征或与SLE、多发性肌炎、硬皮病及类风湿关节炎相关的继发干燥综合征引起的口干和眼干症状相关的有用的标志。除了常见于原发干燥综合征外，抗Ro (SS-A)和抗La(SS-B)抗体在SLE患者中的阳性率分别为10%～50%和10%～20%(表21一3)。阳性率的不同与检测方法和种族差异有关 (图21一5)，Ro (SS-A)和La (SS-B)抗原系统共有3种抗原。
  
     1.抗原系统   
      SS-A/Ro抗原之一是 60kD的蛋白质(Ro60 )，结合在4个称为hY1,hY3,hY4和hY5的小RNA的茎部。小的胞浆核糖核蛋白hYl的结构见图21一6B。另一个52kD的蛋白质(Ro52)与很多抗Ro (SS-A)抗体阳性的血清发生反应。Ro52是否和Ro60或Y RNA之间存在相互作用仍有争议。虽然Ro52和Ro60的功能仍未完全清楚，但有研究提示Ro60蛋白参与质量控制途径，以去除有缺陷的5SrRNA分子。与所认定的Ro60的功能相一致，该抗原至少部分分布于胞浆内，尽管也有报道它可以存在于细胞核内。
      La (SS-B)抗原是一种47 kD的磷酸化蛋白，与RNA聚合酶Ⅲ合成的小RNA前体短暂相关。La抗原通过一个 RNA识别基序 (motif)与这些RNA 3’端的一小段尿苷酸(uridylate)残基结合(图21一6B)。La (SS-B)蛋白是RNA聚合酶Ⅲ的转录终止因子，具有ATP酶活性，能够溶解DNA/RNA杂合子。La (SS-B)抗原主要位于核内。   
/ ]) ]9 \0 p2 c3 J5 {      2.抗Ro (SS-A)抗体和抗La (SS-B)抗体相伴产生   
      事实上，抗 La (SS-B)抗体总是和抗Ro(SS-A)抗体相伴出现，而抗Ro (SS-A)抗体则可不伴随抗La (SS-B)抗体而单独出现。在一项研究中发现，55例抗Ro/La抗体阳性的血清中，23例两者皆阳性，30例仅抗 Ro (SS-A)抗体阳性，只有2例仅抗La (SS-B)抗体阳性。因此，与抗nRNP/Sm抗体系统相似，抗Ro (SS-A)抗体和抗La (SS-B )抗体也是一对“相互关联”的抗体系统。针对 Ro核糖核蛋白中的hY5 RNA部分(不包括其他的 Y RNAs)的抗体一般也与抗 Ro (SS-A)抗体一起产生。   
+ V& Z' D+ M5 [; o) |4 l2 T. `7 J      3.临床意义   
      抗Ro (SS-A)抗体和抗La (SS-B)抗体常见于各种病因引起的干燥综合征患者。重要的临床相关性不仅包括口干症 (sicca symdrome)，也见于亚急性皮肤型狼疮、新生儿狼疮以及先天性心脏传导阻滞。这些抗体通过胎盘诱发新生儿狼疮提示它们有直接的致病作用。
- p/ a% S; ]! `      (1)原发性和继发性干燥综合征:免疫双扩散法可检测到抗Ro (SS-A)抗体出现于60～80%的原发干燥综合征患者和 10%～50%的SLE患者。抗Ro (SS-A)抗体在类风湿关节炎患者中的阳性率较低，部分健康者也可出现该抗体阳性。抗Ro(SS-A)抗体在中国SLE患者中的阳性率较美国白人和黑人要高(图21一5)。抗Ro(SS-A)抗体阳性的SLE患者容易继发干燥综合征或者亚急性皮肤型红斑狼疮。伴有继发干燥综合征的SLE患者的抗Ro(SS-A)抗体阳性率为70%;亚急性皮肤型狼疮中环形红斑狼疮患者的阳性率为60%～80%。抗Ro(SS-A)抗体在这些皮肤损害中可能具有直接的病理作用。针对52kD的抗Ro (SS-A)抗体的临床意义仍不清楚。抗 Ro-52kD抗体阳性且无抗Ro-60kD抗体主要与原发干燥综合征相关，而抗Ro-60kD抗体阳性且无抗Ro-52kD抗体通常与系统性红斑狼疮相关。也有报道前一种与多发性肌炎也有相关性。抗La (SS-B )抗体在原发干燥综合征和伴有继发干燥综合征的SLE中有较高的阳性率，分别为 47%和50% ，而在不加选择的SLE患者中的阳性率为10%～20%。  
; F) Z8 @/ s- i$ e! F: a6 B      (2)新生儿狼疮综合征和先天性心脏传导阻滞:新生儿狼疮综合征包括类似于亚急性皮肤型狼疮的皮疹和先天性心脏传导阻滞。新生儿狼疮综合征和来自母体的抗Ro (SS-A)抗体密切相关。新生儿狠疮的皮疹为暂时性的，当母体IgG从新生儿体内排除后即可消失。  
      先天性心脏传导阻滞通常出现于孕期的第二个3个月后期(妊娠22周后)，与抗 Ro (SS-A)抗体和抗La (SS-B)抗体密切相关。心脏的损伤见于胎儿而非母亲，提示在胎儿发育过程中有一个易感的窗口期。抗Ro52抗体或抗La抗体阳性者发展为先天性心脏传导阻滞的危险性高于抗Ro 60抗体阳性者。在新生儿狼疮患儿的母亲，抗Ro52和抗 La抗体同时阳性的几率增高，其优势比(odds ratio, OR)为35。抗Ro52抗体在完全性心脏传导阻滞的胎儿心脏组织中浓集，它可能通过Fc受体介导的炎症反应诱导TNF-α的产生，并最终导致心肌病变和继发于传导组织纤维化的完全性传导阻滞。然而，抗Ro52抗体或抗La抗体阳性的母亲所生的胎儿发展为完全性传导阻滞的危险性并不高。抗 Ro52抗体或抗 La抗体和先天性完全性心脏传导阻滞的密切关系，提示对患有免疫系统疾病的孕妇进行筛查是有价值的。抗Ro52抗体或抗La抗体阳性的妇女在怀孕期间应该对胎儿心脏进行严密监视。血浆置换可以降低抗体的滴度，改善患儿心脏的病症。糖皮质激素对于抑制胎儿心脏炎的临床表现也有一定作用。地塞米松为首选的糖皮质激素，因为它不需经胎盘代谢而以活性形式直接作用于胎儿。
. w1 R' H5 R+ {% v( D      4.抗Ro (SS-A)抗体和抗La (SS-B)抗体的检测   
: }# F& r/ L. j# ?% ~      抗Ro52抗体、抗 Ro60抗体以及抗 La(SS-B)抗体有多种检测方法，其中对流免疫电泳(CIE)和双向免疫扩散用于抗Ro (SS-A)和抗La (SS-B)抗体的检测已有多年的历史。应该使用诸如脾或 Wil-2细胞提取物等人的底物，因为人类的抗体与其他物种的Ro抗原之间可能无交叉反应。而且，其他一些组织提取物中Ro52的含量很少。CIE和双向免疫扩散不能检测出抗Ro52抗体，该抗体一般不与抗原发生沉淀反应。部分抗La (SS-B)抗体也不发生沉淀反应。   
+ z4 P$ q+ O( N0 W' Z      抗Ro 52和抗Ro 60抗体可以用免疫印迹法作鉴别。对抗 Ro52抗体来说，免疫印迹法是一种很好的检测方法。但是用这种方法检测抗Ro60抗体有时并不可靠，因为许多血清中的自身抗体主要针对的是天然形式的抗原。免疫印迹法对于检测抗 La (SS-B)抗体非常敏感。用重组抗原作底物藉ELISA法检测抗La抗体是可靠的，现已广泛使用。采用这种方法检测抗Ro52和Ro60抗体已用于科研，并逐渐扩展至临床。用生化方法纯化的细胞抗原作底物可以提高抗Ro60抗体的ELISA法检测的敏感性。   
      用[35s]标记的蛋白或[32P]标记的小RNA作抗原行免疫沉淀是检测抗Ro60抗体和抗La抗体的金标准。抗 Ro60抗体免疫沉淀一种具特征的60kD蛋白和一组小 RNA (hYl, hY3,hY4和hY5 )。抗La (SS-B)抗体则免疫沉淀一种47kD蛋白和由RNA聚合酶Ⅲ合成一系列小RNA(7SL,5S及转移RNA等)。免疫印迹法是检测抗Ro52抗体的金标准。

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核仁着染是免疫荧光法检测硬皮病的ANA最常见的荧光模式(彩图21一3E)。硬皮病特异性自身抗体识别的核仁抗原包括原纤维蛋白(fibrillarin) , To/Th核糖核蛋白以及 RNA聚合酶 I(表 21一2)。针对拓扑异构酶 I(topoisomerase I , Scl-70，是一种核浆蛋白)、RNA聚合酶Ⅲ(核浆内)以及着丝点的自身抗体是临床上有用的标志物。抗Scl-70抗体和抗RNA聚合酶Ⅰ/Ⅲ抗体阳性提示预后不良(图21一7A)，可有躯干近端皮肤的弥漫性，而非局限性受累。针对RNA聚合酶II的抗体也可以出现于硬皮病，但无疾病特异性。抗原纤维蛋白抗体(5%～8%的患者)和抗 To/Th抗体(2%～5%的患者)虽然并不常见，但具有诊断意义(表21一2)。抗Scl-70抗体检测已广泛应用，但其他抗体目前主要用于科研。由于抗RNA聚合酶Ⅰ/Ⅲ抗体阳性提示预后不良，并具有较高的阳性率，因而有必要广泛的筛查这些抗体。与抗Sm/RNP抗体类似，硬皮病相关的抗体也有显著的人种/种族差异性。
* j% G" `4 B% ~

# I6 w) z. J5 a4 {5 B- W2 t   一、抗Scl-70(拓扑异构酶I)抗体   
     抗Scl-70抗体可见于15%～80%的硬皮病患者，依人种和种族不同而有差异(表21一3)。Reveille等人发现美国黑人抗 Scl-70抗体阳性率为37% ，白人为17%。该抗体在亚洲人中的阳性率也较高。据报道，日本的硬皮病患者该抗体的阳性率为25% ，泰国为88% ，澳大利亚为26% 。曾有报道说，澳大利亚白人硬皮病患者和亚洲人(泰国)硬皮病患者抗Scl-70抗体识别的表位不同。美国白人与黑人的硬皮病患者之间以及日本硬皮病患者该抗体识别的表位也有显著的差异。这些差异可能反映了不同种族间MHC- II和环境作用的差异。  
0 R7 g7 a- W, \7 ^      1.抗原   
      虽然“Scl-70”的名称源 自抗原的分子量70kD，但70kD抗原是分子量为100kD的完整的DNA拓扑异构酶Ⅰ蛋白的降解产物。DNA拓扑异构酶Ⅰ是染色体复制过程中必需的一种DNA解旋酶，人血清中的抗Scl-70抗体可抑制该酶的活性。
% Y% u; A: |( U      2.临床意义   
; S1 E; v& |# O) Z( i  Y1 N      抗Scl-70抗体和弥漫性硬皮病高度相关，并且提示预后不良(图21一7A)。该抗体可以在患者发病前出现。已发现抗Scl-70抗体阳性的无症状患者或伴有孤立性雷诺现象的患者可在数月至数年后发展为具有硬皮病特点的结缔组织病。部分确诊的硬皮病患者抗Scl-70抗体可以消失，这种情况一般预后良好。
0 ^4 X; ?: }: d7 W* _7 B      3.抗Sel-70抗体的检测   
      以小牛胸腺提取物为抗原，采用双向免疫扩散法检验抗 Scl-70抗体是一种可靠的方法。也可采用免疫印迹法或免疫沉淀法，商业化的ELISA法也被广泛采用，但该方法的假阳性率较高，由此判断结果需要谨慎;而这已导致了一些未经证实的结论，如认为抗Scl-70抗体与包括SLE在内的许多疾病相关。因此必须用第二种检测方法来确认抗Scl-70抗体阳性这一结果，以评估这些研究的意义。在研究中采用以肽为底物的ELISA法更具疾病特异性，优于商业化的检测试剂盒。免疫沉淀法存在的问题是，在SDS-聚丙酰胺凝胶中有大量的蛋白迁移至70kD处。其他检测方法应该与之相比较的抗Scl-70抗体检测金标准可能是酶活性抑制试验，采用这一标准，双向免疫扩散的敏感性可达79% ，免疫印迹则接近 100% 。
   二、抗RNA聚合酶抗体   
      抗RNA聚合酶I、Ⅱ和III的抗体见于5%～20%的硬皮病患者(图21一8)。文献报道，日本 275例硬皮病患者的抗 RNA聚合酶I、Ⅱ和/或III抗体的阳性率为5%。但在其他研究中，日本硬皮病患者的抗RNA聚合酶I/III抗体的阳性率为3%，而抗 RNA聚合酶II抗体的阳性率为21%。与此大不相同的是，美国黑人和白人硬皮病患者的抗RNA聚合酶II抗体阳性率分别为5%和0。


' v6 d9 P' w% |' p5 O  P2 b+ K. I      1.抗原   
      RNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ是多蛋白复合物，包括10种或更多种能合成核糖体 RNA和一类小RNA的蛋白质。RNA聚合酶Ⅰ定位于核仁，在检测ANA时其抗体呈核仁型。RNA聚合酶I最大的亚单位分别是190kD和126kD的蛋白，而RNA聚合酶Ⅲ最大的亚单位是 155kD和138kD的蛋白，它们是抗体的主要靶抗原。   
9 e" M' S4 R3 a# h8 p      RNA聚合酶II是一种多蛋白复合物，包括8～12种与合成mRNA相关的蛋白质。在具有转录活性的RNA聚合酶II中，其最大亚基的C-末端已磷酸化。正如RNA聚合酶Ⅰ、Ⅲ的亚基一样，RNA聚合酶Ⅱ两个最大的亚基(220kD和140kD)也是自身抗体识别的主要蛋白。在个别情况下，更小的亚基也会被自身抗体识别。虽然RNA聚合酶Ⅰ、II和Ⅲ具有不同的大亚基，但它们共有一些小的亚基。因此部分血清可以和3种酶都发生免疫沉淀反应。
4 z% W/ c$ O! S1 D+ H0 D' R. }% w      2.临床意义   
& U  ~$ t; n: ?5 v      抗RNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ的抗体和硬皮病高度相关，并提示预后不良(图21一7A)。虽然抗RNA聚合酶I和Ⅲ的抗体基本上只见于硬皮病患者(表21一3)，但是抗RNA聚合酶II抗体不仅见于硬皮病患者，还可见于10%～15%SLE患者的血清中(与人种/种族有关)。一些血清对具有转录活性形式的RNA聚合酶II高度特异，因为此时该酶含有过磷酸化(hyper-phosphorylated)的大亚基。在日本硬皮病患者中，对磷酸化形式的 RNA聚合酶II特异的抗体与抗 Scl-70抗体相关，两种抗体同时阳性提示病情非常严重，而且预后不良。   
      3.抗RNA聚合酶抗体的检测   
" P6 T2 X2 ^0 e      目前检测抗RNA聚合酶Ⅰ、II和Ⅲ的抗体惟一可靠的方法是免疫沉淀法。然而，近来已经开展了基于重组多肽的ELISA法，用于抗RNA聚合酶Ⅲ抗体的检测，这一方法可能有希望用于临床。
/ f* e: r0 M, Y$ T' k" f. D   三、抗原纤维蛋白抗体
      抗34kD的原纤维蛋白抗体对硬皮病具有高度特异性。ANA检测时该抗体呈核仁型的免疫荧光模式。约5%的硬皮病患者抗原纤维蛋白抗体阳性。   
; _! u$ [! E$ u% C/ V      1.抗原   
3 v3 ~& n7 V. C( a) }8 _1 X      原纤维蛋白是一种与U3小核仁RNA相关的34kD核仁蛋白。U3核仁核糖核蛋白在核糖体RNA的形成中起作用。
  x# R3 `' ?# b+ V$ I, M& c      2.临床意义   
4 p  s( D1 _; `! [( R      抗原纤维蛋白抗体阳性提示预后不良，但其相关性不如抗 Scl-70抗体和抗 RNA聚合酶抗体强。   
      3.抗原纤维蛋白抗体的检测   
      筛查抗原纤维蛋白抗体可采用免疫荧光法，免疫荧光的核型呈“块状”核仁型。可以将免疫沉淀法认为是检测34kD蛋白或U3小核仁RNA的金标准，尽管该抗体也可采用双向免疫扩散和免疫印迹的方法进行检测。
   四、抗.丝点抗体   
      抗着丝点抗体(anti-centromere antibodies)与症状较轻的硬皮病相关。在一项研究中，抗着丝点抗体见于36%的美国白人硬皮病患者，但仅见于4%的美国黑人硬皮病患者。日本硬皮病患者该抗体的阳性率为19%。
" h2 H- e0 a" v% G4 {- e      1.抗原   
9 a$ T' j( v9 b4 ]! z7 E      与着丝点具有反应性的血清通过间接免疫荧光法很容易确定(彩图21一3D).荧光核型呈多个不连续的点状，它们与有丝分裂相浓缩的染色体具有相关性。抗着丝点抗体阳性的血清识别 3种主要的抗原:CENP-A (17kD),CENP-B (80kD)和CENP-C(l40kD)，其中最重要的是CENP-B。
      2.临床意义   
6 s2 d) U1 F( |' Z; ^% @      抗着丝点抗体与 CREST综合征(钙化、雷诺现象、食管运动功能障碍、指端硬化和毛细血管扩张)及局限性硬皮相关，并提示预后相对较好(图21一7A)。抗着丝点抗体阳性的患者经常具有指端硬化，但并不发展为近端硬皮病或有内部脏器受累。Fritzler等人报道 27例CREST患者中有26例抗着丝点抗体阳性。此外，26例硬皮病、14例孤立性雷诺现象、15例混合结缔组织病和60例SLE中分别有3例、4例、1例和1例抗着丝点抗体阳性，30例类风湿关节炎患者中无 1例阳性。然而，尽管抗着丝点抗体的敏感性很高，但它对CREST综合征并非高度特异。抗着丝点抗体也偶见于其他的结缔组织疾病，如狼疮以及一些有症状或无症状的孤立性雷诺现象，然而，这些患者最终仍将发展为硬皮病一类的疾病。   
      3.抗着丝点抗体的检测   
% Y* Q( l  M) h$ {6 n1 }       检测抗着丝点抗体最广泛应用的方法是标准的ANA免疫荧光法。

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在多发性肌炎与皮肌炎患者的ANA免疫荧光检测中，胞浆型染色是最常见的模式(彩图21-3F)。针对胞浆抗原产生的自身抗体具有诊断意义。大部分胞浆抗原是tRNA合成酶。这些抗体在非肌炎的情况下很少出现。肌炎特异性的自身抗体包括抗tRNA合成酶抗体和抗信号识别颗粒(SRP)抗体(表21-2)。关于这些自身抗体出现几率的种族差异，目前还知之甚少。
   一、抗 tRNA合成酶抗体   
# s/ `5 [( K1 ~0 U* Z      最常见的这类自身抗体是抗Jo-1抗体(组氨酰tRNA合成酶)，存在于大约20%成年肌炎的患者。其他的自身抗体很少见，只出现1%～5%的肌炎患者中。然而，很少有患者具有一种以上的自身抗体，所以将相关的tRNA合成酶归为一类自身抗体可算是相对常见的。肌炎患者血清可识别的其他tRNA合成酶包括苏氨酰(抗PL-7，见于3%的患者)、丙氨酰(抗PL-12，见于3%的患者)、异亮氨酰(抗OJ，见于2%的患者)、甘氨酰(抗EJ，见于2%的患者)及天冬氨酰(抗KS，见于1%以下的患者)tRNA合成酶(表3和4)。通常一个患者只能检测到一种抗合成酶抗体，其原因尚不清楚。   
      1.抗原   
      抗tRNA合成酶抗体识别那些把适当的氨基酸加到转运 RNA分子中去的酶。许多这类酶能被肌炎患者血清识别。抗-OJ抗体可以识别异亮氨酰 tRNA合成酶，后者是至少由七个tRNA合成酶组成的多蛋白复合体的一部分。因此，抗OJ抗体的免疫沉淀反应可产生多条带。表21-4列出了主要的抗 tRNA合成酶抗体的分子量。   

9 X: J3 ~  L2 o3 G

0 O- p  b+ N# v* O* i/ F( W2 o      2.临床意义   
9 q% L. f# ^+ O8 A      所有的抗tRNA合成酶抗体都与肌炎、间质性肺疾病、雷诺现象、机工手(指尖皮肤粗糙)、关节炎以及发热等一系列症状相关，故称为“抗合成酶抗体综合征”。与那些抗RNA合成酶抗体阴性或有抗其他肌炎标志(如Mi-2 )抗体(图21-7B)的患者相比，这些患者的预后相对要差。在缺少肌炎表现的情况下，抗丙氨酸tRNA合成酶抗体通常和肺间质病变相关。抗甘氨酸:RNA合成酶抗体(抗EJ抗体)也可以出现在没有肌肉病变的患者中，或先于肌病出现。抗Jo-1抗体也可以在疾病发作前出现。上述事实为提议对所有特发性肺间质病变的患者筛查这些抗体提供了有力证据。已有报道认为抗Jo-1抗体和抗EJ抗体水平与疾病活动度相关，所以追踪抗合成酶抗体的水平可能很有意义。然而，到目前为止，除抗Jo-1外的其他抗体检测还未被广泛应用。
      3.抗tRNA合成酶抗体的检测   
2 f1 k; p! @# B2 C; X% }      抗tRNA合成酶抗体可与特异性蛋白以及它们相关的tRNA分子发生免疫沉淀反应。这些特异性蛋白可以通过分子量不同加以鉴别(表21一4)。同样，相关的tRNA也有不同的迁移率，这可用同位素标记RNA的免疫沉淀法来辨别。用其他方法所作的检测结果并不一致。免疫双扩散法(组氨酰、丝氨酰)和免疫印迹法(甘氨酰、赖氨酰)也已被应用。
. P( H% v% t; j$ r- [9 |   二、抗信号识别颗粒(SRP )抗体   
( I$ f. w1 u% A, n3 D3 q      抗信号识别颗粒(SRP)抗体是肌炎的一种标志性抗体。4%的患者中存在这一抗体。它可能也是重型肌炎的一个标志。   
+ R& F$ v7 V- T9 P/ j/ Q* R$ f* `      1.抗原   
      抗SRP抗体识别一种由7SL RNA和72,68,54,19,14及9kD蛋白组成的RNA蛋白复合物。主要的抗原决定簇位于54kD蛋白。这个抗原位于细胞质(彩图21一3F)，在调节新合成的蛋白转移到内质网的过程中起关键作用。   
5 F; R8 \- |1 m& I) A# ?+ P: L      2.临床意义   
* m2 d4 G0 V9 q      抗SRP抗体对多发性肌炎高度特异，并预示预后不良。与抗tRNA合成酶抗体阳性的患者相比，抗SRP抗体阳性患者的存活率明显降低(图21一7B)。因此，检测抗 SRP抗体有助于决定是否需加强治疗力度。   
: Z3 Y* }* p& K) V- u      3.抗SRP抗体的检测   
      目前检测抗SRP抗体惟一的方法是免疫沉淀法。
   三、抗Ku抗体
      抗Ku抗体见于多种疾病，包括多发性肌炎、狼疮及硬皮病。其种族差异性很大，在美国的白人中很少见，而14%的美国黑人存在此抗体，在亚州(日本)也相对多见。   
6 O5 B) k# Z5 Q" X* `: i' _      1.抗原   
      抗Ku抗体识别的是参与DNA修复、V(D)J重组、转录激活的一个赖DNA蛋白激酶(DNA-PK)的DNA结合亚单位。抗催化亚单位DNA-PKCS的自身抗体也已有报道。Ku抗原由结合于双链DNA末端的70kD和80kD两个蛋白组成。抗Ku70, Ku80及DNA-PKCS抗体构成一组相关联的抗体。
      2.临床意义   
      许多自身免疫病都发现有抗Ku抗体。它是日本人首次在55%的多发性肌炎-硬皮病重叠综合征患者的血清中发现的。在美国和欧洲的患者，出现抗Ku抗体主要与SLE或重叠综合征有关，但有报道硬皮病、多发性肌炎、干燥综合征、类风湿关节炎及原发性肺动脉高压的患者也可出现。有证据显示，这些抗体的出现可能意味着有发展为肌炎的高度危险，而且这与原发病并无关系。  
' h1 }3 b+ e4 R0 a) ~      3.抗Ku抗体的检测   
/ K/ U8 I5 b+ a8 v  T      抗Ku抗体可通过免疫双扩散法、ELISA、蛋白印迹法或免疫沉淀法进行检测。

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自身免疫(有或无明确疾病的情况下，机体发生调控障碍产生自身反应性B或T细胞和/或自身抗体)也许会在几年中发展为自身免疫病(由自身抗体或T细胞介导的组织损伤)。有证据显示，健康人在发生明确的自身免疫病前的几个月、几年、甚至几十年都可能检测到疾病特异性的或疾病相关的自身抗体。在美国军人中的筛查显示，130例狼疮患者的连续血清标本中存在抗dsDNA、抗Ro、抗Sm及抗RNP抗体。血清样本的采集最早在建立诊断的9年前便开始了。在明确诊断前其中有 72例检测到抗dsDNA抗体，这些抗体首次发现阳性的时间比疾病开始早平均2.7年(从9.3年到<1个月)。抗Ro (SS-A)抗体是无症状者最常见的自身抗体。与此相似，抗着丝点或抗拓扑异构酶抗体提示有发生系统性硬化的潜在危险。肌炎的自身抗体也可以在发病前出现。肌病发生若干年前便可出现肌炎特异性的自身抗体。对丙酮酸脱氢酶中的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶成分(E2)特异的抗线粒体抗体可以出现在胆汁性肝硬化发生之前的几年到几十年，这种抗体也许在无症状的情况下或在其他自身免疫病中产生。在Pima印第安人这个类风湿关节炎高发的人群中，类风湿因子的滴度可提示发生疾病的可能性。甲状腺过氧化物酶抗体高滴度提示将有TSH水平升高或甲状腺功能减退。在证实有 1型糖尿病的家族成员中，有30%～60%与糖尿病相关的一种自身抗体阳性者，将在5～10年内发病。   
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      因此，特异性自身抗体可能成为以后出现自身免疫病的有效预告。但是，对它们在有危险因素的人群以及普通人群中出现的频率还研究得很少。另外，关于什么是决定自身抗体阳性个体保持无症状状态还是发展成自身免疫病的危险因素也研究得很少。鉴于它们在诊断及预后判断上的重要性，有必要建立可靠的实验室检测去评估自身抗体细微的特异性，像这样的检测在过去50年中已取得了相当大的进步。

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目前已有多种方法用于人血清中自身抗体的检测及定量。以下是有关这些方法的简要描述。如需更加详尽的信息，读者可参阅文献Rose NR等主编的“Manual of Clinical Laboratory Immunology"。  
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      1.免疫荧光法   
  m3 i1 d8 r# k" m7 I1 Q+ X2 `/ ~
      间接免疫荧光法已在ANA筛查中讨论过(图21一2)。免疫荧光法也用于检测抗 DNA抗体(短膜虫法检测)，检测步骤类似于ANA的检测。为获得半定量数据，可将血清样本进行连续稀释(1:40,1:80,1:160,1:320,1:640,1:1280等)。检测ANA和抗 dsDNA抗体的荧光滴定法在某种程度上带有主观倾向，因为它需要通过视觉判断截点。为减少荧光测定法的主观误差，研究出了滴定效价法。对抗 dsDNA抗体测定来说，用绿蝇短膜虫测定盒做筛查可用1:10稀释的血清。凭借能从每一个样本的单次稀释中获得多个影像(image)，滴定效价法被用于模拟传统的滴定法。通过改变曝光时间，一架安置于显微镜上的摄像机可自动获得模拟连续稀释的不同影像，从而产生一个“图像滴度(image titer) "。用稀释到1:10,1:40,1:160及1:640的参照血清制作出标准曲线。结果具有可重复性，且可能比视觉判断的结果更精确。   
9 D* d/ J9 {$ u0 A- A
; }6 ^5 N1 J' i      2.酶联免疫吸附测定法(ELISA )   

      ELISA法是一种简单、快速和敏感的方法，普遍用于筛查。但最好的做法是，在应用ELISA法进行筛查的同时，用特异性高的检测方法进行确认。在有许多小孔的高亲和性(氧化聚苯乙烯)微量滴定板(目前最常用的为 96%孔板)上包被纯化的抗原，将稀释的待测血清及酶标的抗免疫球蛋白抗体加人加样孔中。结合的二抗通过加人的底物形成有颜色的产物，用分光光度计测定吸光度可以半定量自身抗体的水平。基于其高敏感性，对ELISA法必须认真实施标准化检测，以避免非特异结合。   
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5 t* m  v. s; I6 @/ q$ A      3.免疫双扩散和对流免疫电泳   

+ M( r4 D9 U# V- l      免疫双扩散(二维双向扩散)是通过把抗原和抗体加入琼脂糖凝胶孔中进行的。每个反应物都通过凝胶放射状扩散，浓度随距孔远近的函数关系逐渐递减。抗原抗体在各自浓度大致相近时相遇，于该处形成一条由免疫复合物形成的不溶性沉淀线。凝胶中的沉淀线可直接看到。如果两个血清样本含有特异性相同的抗体，它们的沉淀线融合而形成一条弯曲的“同一性线(line identity) "。免疫双扩散法广泛地用于检测抗Sm、抗nRNP、抗Ro (SS-A )、抗La(SS-B),抗拓扑异构酶I及抗核糖体P抗体。但是，它需要投人较多的人力，且敏感型较诸如ELISA等其他方法低。   

对流免疫电泳比免疫双扩散法敏感。酸性抗原和血清免疫球蛋白相向电泳，形成沉淀线。其优点是使免疫双扩散法测试中无法区分的多条线被区别开来。但是，由于非免疫沉淀线的形成，故使结果的解释复杂化。   

      4.蛋白印迹法   
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( \  F5 e# e5 a, S- n$ q      在免疫印迹(蛋白质印迹)技术中，蛋白质从粗提或纯化的抗原制备物中依据分子量的不同藉 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳被分离开，随后被转移到如硝酸纤维膜的膜上。将膜用稀释的待测血清孵育，然后加人酶标二抗。酶作用于底物形成有色的、不溶性的反应产物，沉淀于膜上。用放射或化学发光检测也可评估待测血清与复杂的混合物中单个蛋白的反应。这一技术的敏感性很高，但技术要求也很高。本法主要的缺点是许多抗原决定簇的构象(conformational)有可能在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中遭到破坏。   
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: a8 `- Y$ Q3 Y8 t) J  F6 N      5.免疫沉淀法   

! o/ |% m- T5 Q      对有放射标记的细胞提取物行免疫沉淀是检测自身抗体特异性的重要研究工具。放射性标记的抗原可与自身抗体形成免疫复合物，这种免疫复合物可在蛋白A琼脂糖凝胶微粒上进行纯化。从凝胶微粒上洗脱下来的蛋白用SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再用放射自显影法检测。这个测试方法可以检测多种与系统性自身免疫病相关的自身抗体。通过与参照血清发生免疫沉淀反应的蛋白作分子量比较，可确定有放射性标记的抗原的性质。相似的方法可用于分析能被人自身抗体识别的核糖核蛋白中放射性标记的核酸成分。

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对特异性自身抗体的检测通常比标准的ANA检测更有临床意义。尽管如此，ANA免疫荧光检测对于疾病的筛选仍有价值，可用来指导进一步的诊断评估。对高滴度阳性ANA的进一步评估具有诊断及评价预后的意义。基于ANA核型绘制的流程图见图21一9。
. ]! a+ o8 B6 i; L      1.着丝点型   
      在有丝分裂间期细胞核内见到的着丝点染色、大的斑点染色及分裂细胞内的致密染色体着色是一种很独特的核型，一般不需要再作进一步的检测。但是，如果不能识别主要的着丝点自身抗原(CENP-B, 80 kD; CENP-A,17 kD;CENP-C,140 kD)，鲜有血清能产生相似的核型。如上文中讨论的那样，抗着丝点抗体阳性的无症状个体日后有可能发展出现硬皮病的表现，因而这一抗体具有监测意义。   
, u6 F) D: e# S6 A: i  T5 @      2.核型(核浆型)   
      多种抗核抗体的核型为均质(弥散)型或斑点型(彩图21一3A)。用核浆染色(均质型、斑点型或混合型)可鉴别诊断抗DNA或组蛋白抗体、抗Sm抗体、抗Scl-70抗体、抗Ro(SS-A)和抗La(SS-B)抗体(图21一9)。尽管上面所列的并不全面，但所指出的特异性最具临床意义。
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/ K6 p, X9 a3 s$ [1 U1 _4 x      3.核仁型   
( B! {7 y. k- ~      单独的核仁染色(彩图21一3E)通常与硬皮病的诊断相关，但也有报道 100kD的核仁RNA解旋酶与“西瓜形胃”的患者相关。临床上有应用价值且能产生单独核仁染色的自身抗体有抗纤维丝抗体和抗To/Th抗体(分别为7-2及8-2核糖核蛋白，或RNA酶P及 RNA酶MRP)。抗RNA聚合酶Ⅰ抗体也表现为单独的核仁型。最后，抗PM-Scl抗原的自身抗体也表现为核仁型染色，这一抗原是由10种或包括75kD和100kD的亚基在内的更多种核仁蛋白组成的复合物。这些自身抗体与多发性肌炎/硬皮病的重叠综合征的一种亚型相关。  
, x% K. S! I8 ?/ j' P0 J      4.胞浆型   
      胞浆型染色可包括抗Ro (SS-A )、抗核糖体P(彩图21一3C)、抗信号识别颗粒(SRP)、抗tRNA合成酶及抗线粒体抗体。大多数与多发性肌炎相关的自身抗体表现为胞浆型(彩图21一3F)。识别丙酮酸脱氢酶的二氢硫辛酰胺乙酰转移酶复合物(E2)的抗线粒体抗体，对原发性胆汁性肝硬化具有高度特异性，这些抗体可在起病前数十年出现。有相当大一部分抗线粒体抗体阳性的无症状个体会发展为胆汁性肝硬化。
( ^1 y2 D) Z$ Y/ f- o+ Y& Z      特异性抗核抗体的早期检测有助于及时进行临床干预。例如，用熊去氧胆酸治疗早期原发性胆汁性肝硬化可以延缓疾病进程，肌炎在病程早期对糖皮质激素有良好的治疗反应。评估ANA阳性，特别是在高滴度的青年个体中，在早期检测及对阳性者进行早期治疗起到重要的决定作用。